结核菌素诊断

结核菌素诊断是一套使用结核菌素（一种高压灭菌的结核分枝杆菌培养滤液）来测定人体对结核分枝杆菌特异性致敏性的诊断测试。结核菌素是一种不完全抗原（半抗原），它本身不具有致病性或免疫力，但会引起与迟发型过敏相关的特异性反应。同时，结核菌素具有高度特异性，即使在极高浓度的稀释度下也能发挥作用。只有在人体因自发感染或卡介苗接种而对结核分枝杆菌产生初步致敏的情况下，才有可能对结核菌素产生特异性反应。

结核菌素的化学成分复杂，包含结核蛋白、多糖、脂质、核酸、稳定剂和防腐剂。结核菌素的生物活性由结核蛋白提供，以结核菌素单位 (TU) 计量，并根据国家标准进行标准化。国家标准必须与国际标准进行比较。在国际实践中，使用 PPD-S（结核菌素 Seibert 或标准结核菌素）。

目前，国内生产以下剂型的PPD-L（林尼科娃国产纯化结核菌素）：

• 标准稀释度的纯化液体结核病过敏原（标准稀释度的纯化结核菌素）是一种即用型结核菌素，可用于批量和个体结核菌素诊断；
• 纯化干粉结核菌素用于皮肤、皮下和皮内使用（纯化干粉结核菌素） - 一种粉末制剂（溶于所提供的溶剂中），仅用于个体结核菌素诊断和抗结核机构的结核菌素治疗。

结核菌素试验的目的

如果人体对结核分枝杆菌预先致敏（通过自发感染或卡介苗接种），则在施用结核菌素后，会发生基于DTH机制的特异性反应。该反应在施用结核菌素后6-8小时内开始发展，表现为不同程度的炎性浸润，其细胞基础是淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮样细胞和巨细胞。DTH的触发机制是抗原（结核菌素）与效应淋巴细胞表面受体的相互作用，导致释放细胞免疫介质，巨噬细胞参与抗原的破坏过程。一些细胞死亡，释放出对组织有破坏作用的蛋白水解酶。其他细胞在病变周围积聚。任何结核菌素应用方法的反应发展时间和形态与皮内给药没有根本区别。 DTH反应的高峰在48～72小时，此时其非特异性成分最少，特异性成分达到最大。

结核菌素诊断分为团块型和个体型。

大规模结核菌素诊断的目的是筛查人群中是否存在结核病。大规模结核菌素诊断的任务包括：

• 识别患有结核病的儿童和青少年；
• 识别有罹患结核病风险的个体，以便结核病科医生进行后续观察（首次感染结核分枝杆菌的个体，结核菌素试验出现“转变”、结核菌素试验增加、结核菌素试验高能、结核菌素试验长期处于中高水平），如有必要 - 进行预防性治疗；
• 选择儿童和青少年进行卡介苗再接种；
• 确定结核病流行病学指标（人口感染率、年感染风险）。

对于大规模结核菌素诊断，仅使用具有 2 TE 的Mantoux 试验，仅使用标准稀释度中的纯化结核菌素。

为了筛选出适合进行卡介苗复种的儿童和青少年，根据预防性疫苗接种时间表，在规定的7岁（中学零年级和一年级）和14岁（八年级和九年级）年龄组中进行结核分枝杆菌感染试验（含2种结核分枝杆菌毒素）。对于先前未感染、临床健康，但结核分枝杆菌感染试验呈阴性的个体，需进行复种接种。

个体化结核菌素诊断用于进行个体化检查。个体化结核菌素诊断的目标是：

• 接种后过敏和感染性过敏（PVA）的鉴别诊断；
• 结核病及其他疾病的诊断和鉴别诊断；
• 确定个体对结核菌素敏感性的“阈值”；
• 确定结核病过程的活动性；
• 治疗效果评估。

在进行个体结核菌素诊断时，各种结核菌素试验均需通过皮肤、皮内或皮下注射结核菌素进行。各种结核菌素试验均需使用标准稀释度的纯化结核菌素（标准稀释度的纯化结核病过敏原）和干纯化结核菌素（纯化干结核病过敏原）。标准稀释度的纯化结核菌素可用于抗结核机构、儿童诊所、体检医院和传染病医院。干纯化结核菌素仅获准在抗结核机构（抗结核门诊、结核病医院和疗养院）使用。

研究方法与结果评估

结核菌素PPD-L制剂可通过皮肤、皮内和皮下给药方式给药。给药途径取决于结核菌素试验的类型。

Grinchar 和 Karpilovsky 分级皮肤测试

GKP 是一种皮肤结核菌素试验，使用 100%、25%、5% 和 1% 的结核菌素溶液。为了获得 100% 的结核菌素溶液，将 2 安瓿瓶中干燥的纯化结核菌素 PPD-L 依次稀释于 1 毫升溶剂中，然后用所得的 100% 溶液制备后续的结核菌素溶液。为了获得 25% 的溶液，使用无菌注射器从装有 100% 溶液的安瓿瓶中抽取 1 毫升溶液，倒入无菌干燥小瓶中。使用另一个无菌注射器加入 3 毫升溶剂，充分摇匀小瓶，即可获得 4 毫升 25% 的结核菌素溶液。配制5%结核菌素溶液，用无菌注射器从装有25%溶液的小瓶中抽取1ml，转移至另一个无菌干燥的小瓶中，加入4ml溶剂，摇匀，即得5ml 5%结核菌素溶液，以此类推。

在用 70% 乙醇溶液预先处理过的前臂内表面干燥皮肤上，用无菌吸量管一滴一滴地滴入不同浓度（100%、25%、5%、1%）的结核菌素，使结核菌素浓度从肘皱褶处向远端方向降低。在含有 1% 结核菌素溶液的一滴下方，滴入一滴不含结核菌素的溶剂作为对照。每种结核菌素溶液和对照使用单独标记的吸量管。用左手从下方拉伸前臂皮肤，然后用天花笔破坏皮肤表层的完整性，以 5 毫米长的划痕形式划过每一滴，沿着手臂的纵轴方向。划痕处理首先通过滴入一滴溶剂进行，然后依次通过1%、5%、25%和100%的结核菌素溶液进行。每次划痕后，用笔的平面摩擦结核菌素2-3次，使制剂渗透皮肤。将前臂打开5分钟使其干燥。每位受试者使用单独的无菌笔。划痕部位出现白色隆起，表明结核菌素有充足的时间被吸收。之后，用无菌棉球去除剩余的结核菌素。

根据NA Shmelev在48小时后对GCP进行评估。对GCP的反应有以下区别：

• 无反应——对所有结核菌素溶液均无反应；
• 非特异性反应-100％结核菌素溶液应用部位轻微发红（极为罕见）；
• 正常反应-对高浓度结核菌素有中等敏感性，对1％和5％结核菌素溶液无反应：
• 高能反应——对所有浓度的结核菌素都有反应，随着结核菌素浓度的增加，浸润的大小也会增加，可能出现水泡坏死性改变、淋巴管炎和筛查；
• 均衡反应——所有浓度的结核菌素的浸润大小大致相同，高浓度的结核菌素不会引起足够的反应；
• 矛盾反应——对高浓度结核菌素的反应较不强烈，对低浓度结核菌素的反应较强烈。

平衡反应和矛盾反应也称为GKP反应不足。有时，GKP反应不足也称为高能反应。

GKP在确定结核菌素过敏性质方面具有鉴别诊断价值。接种GRT疫苗后，GKP反应以正常反应为主，而IA患者对GKP的反应可能为高反应性、平衡性或矛盾性。在原发感染早期（“转变”），伴随功能性改变，可观察到矛盾性平衡性反应。

对于成功从原发性结核病感染中幸存下来的健康儿童来说，GKP 也可能是正常的。

肺结核病史（GKP）对于结核病与其他疾病的鉴别诊断以及确定结核病活动性至关重要。活动性结核病患者更常出现高能反应、平衡反应和反常反应。重症结核病患者可能伴有高能反应。

根据GKP数据，在抗菌治疗的背景下，结核病患者对结核菌素的敏感性降低（从高反应到正常反应，从不足到足够，从精力充沛到阳性正常反应的转变），表明身体反应性的正常化和治疗的有效性。

不同稀释度结核菌素皮内试验

初始结核菌素溶液的制备方法是：将一安瓿瓶中装有干燥纯化的结核菌素PPD-L（5万TU）与一安瓿瓶溶剂混合；由此可得到结核菌素的基础稀释液——1毫升含5万TU。将制剂溶解1分钟，直至溶液澄清无色。结核菌素的第一级稀释液的制备方法是：将4毫升溶剂加入装有基础稀释液的安瓿瓶中（0.1毫升溶液中含1000TU）。结核菌素的第二级稀释液的制备方法是：将9毫升溶剂加入1毫升第一级稀释液中（0.1毫升溶液中含100TU）。所有后续的结核菌素稀释液（直至第八级）均以类似方式制备。因此，结核菌素的稀释度对应于 0.1 毫升溶液中的结核菌素剂量如下：第一次稀释 - 1000 TE，第二次 - 100 TE，第三次 - 10 TE，第四次 - 1 TE。第五次 - 0.1 TE，第六次 - 0.01 TE。第七次 - 0.001 TE。第八次 - 0.0001 TE。

使用不同稀释度的结核菌素进行曼图氏试验的方法与使用2种稀释度的结核菌素进行曼图氏试验的方法相同。每种稀释度均使用单独的注射器和针头。在一只前臂上，分别以6-7厘米的间距使用两种稀释度的结核菌素进行测试。同时，可以在另一只前臂上，使用另一种稀释度的结核菌素进行第三次测试。测试结果在72小时后评估：

• 阴性反应-没有丘疹和充血，仅存在刺痛反应（0-1毫米）;
• 可疑反应-小于5毫米的丘疹或任何大小的充血；
• 阳性反应-丘疹5毫米或以上。

滴定（确定结核菌素敏感性阈值）在对最小稀释度的结核菌素出现阳性反应后完成。对0.1 TB、0.01 TE等高浓度结核菌素出现阳性反应，表明机体高度致敏，通常伴有活动性结核病。绝大多数患者对100 TE出现阴性反应（概率为97-98%），这使我们能够排除结核病的诊断或排除过敏的传染性。

在绝大多数患者和感染者中，进行皮肤和皮内结核菌素试验时仅检测到局部结核菌素反应。在个别病例中，使用2个结核分枝杆菌（TE）进行结核菌素试验时可观察到全身反应。此类患者需接受全面的临床和放射学检查。局部反应更为罕见。

科赫皮下结核菌素试验

科赫皮下结核菌素试验是皮下注射结核菌素。

在儿科实践中，科赫氏试验通常以20 TE开始。为此，皮下注射1 ml标准稀释度的纯化结核菌素或0.2 ml干燥纯化结核菌素的3倍稀释度，无需考虑对结核菌素敏感性阈值的初步研究。

对于结核分枝杆菌结核分枝杆菌试验（Mantoux test）反应正常的儿童，如果结核分枝杆菌...

在科赫测试中，会出现局部、全身和局部反应。

• 结核菌素注射部位出现局部反应，当浸润灶大小为15-20mm时为阳性。若无全身及局部反应，则意义不大。
• 局部反应——结核菌素注射到结核病灶后的变化。除了临床和放射学体征外，建议在注射结核菌素前后检查痰液和支气管灌洗液。阳性局部反应（临床症状加重、放射学检查发现病灶周围炎症加重、出现细菌分泌物）对于结核病与其他疾病的鉴别诊断以及确定结核病活动性都具有重要意义。
• 一般反应表现为整个身体状况（体温、血液的细胞和生化成分）的恶化。
  • 如果体温比皮下注射结核菌素前的最高体温升高0.5°C，则可判定为体温反应阳性（建议每3小时测量一次体温，每天6次，共7天，即在检查前2天和检查后5天）。绝大多数患者在第2天即可观察到体温升高，但也可能在第4-5天出现体温升高。
  • 皮下注射结核菌素30分钟或1小时后，可见嗜酸性粒细胞绝对数量减少（FA Mikhailov试验）。24-48小时后，血沉增加5 mm/h，中性粒细胞带数量减少6%以上，淋巴细胞含量减少10%，血小板减少20%以上（Bobrov试验）。
  • 皮下注射结核菌素后24-48小时，由于白蛋白含量下降，α ₁、α ₂和γ球蛋白增加，白蛋白-球蛋白系数降低（Rabukhin-Ioffe蛋白-结核菌素试验）。当指标与初始水平相比变化至少10%时，该试验为阳性。

替代方法

除了体内使用的结核菌素外，还研制出了体外使用的制剂，其生产使用了结核菌素或各种分枝杆菌抗原。

为了检测结核分枝杆菌抗体，我们制备了一种诊断液，即红细胞结核抗原干粉——用磷脂抗原致敏的绵羊红细胞。该诊断液用于进行间接血凝反应 (IHA)，以检测结核分枝杆菌抗原的特异性抗体。该免疫学检测用于确定结核病活动性并监测治疗效果。酶联免疫吸附试验 (ELISA) 也用于测定患者血清中的结核分枝杆菌抗体——一组用于进行 ELISA 的成分。用于实验室确诊不同部位的结核病，评估治疗效果，并决定是否进行特异性免疫治疗。 ELISA对结核病的敏感性较低，为50-70％，特异性低于90％，这限制了它的使用，并且不允许使用该测试系统进行结核病感染的筛查。

PCR 检测系统用于检测分枝杆菌。

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结核菌素试验的禁忌症

2 TE 结核菌素试验的禁忌症：

• 皮肤病、急慢性感染性疾病、躯体疾病（包括癫痫）发作期；
• 过敏性疾病，急性和亚急性期的风湿病，支气管哮喘，病情恶化时有明显的皮肤表现的特质;
• 对儿童群体进行儿童感染隔离；
• 与其他预防性疫苗接种（DPT、麻疹疫苗等）间隔少于1个月。

在这些情况下，结核菌素试验是在临床症状消失 1 个月后或解除隔离后立即进行的。

皮肤和皮内结核菌素试验没有绝对禁忌症。不建议在慢性过敏性疾病、剥脱性皮炎、脓疱性皮肤病或急性呼吸道感染发作期间进行。

对于患有活动性风湿病的患者，尤其是患有心脏病的患者，以及在消化器官慢性疾病恶化期间，不宜皮下注射结核菌素。

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影响结核菌素试验结果的因素

结核菌素反应的强度取决于许多因素。儿童对结核菌素的敏感性高于成人。在严重结核病（脑膜炎、粟粒性结核病、干酪性肺炎）中，由于机体反应性受到严重抑制，结核菌素敏感性通常较低。相反，某些类型的结核病（眼结核病、皮肤结核病）通常伴有较高的结核菌素敏感性。

对2TE的反应强度取决于结核分枝杆菌复种的频率和接种次数。每次复种都会增加对结核菌素的敏感性。反过来，降低卡介苗复种频率会导致结核分枝杆菌试验阳性结果数减少2倍，高能试验阳性结果数减少7倍。因此，取消复种有助于确定儿童和青少年结核分枝杆菌感染的真实水平，从而确保在规定时间内为所有青少年提供卡介苗复种覆盖。

揭示了结核菌素反应强度与接种后卡介苗标记大小的关系，接种后卡介苗标记越大，对结核菌素的敏感性越高。

在蠕虫感染、甲状腺功能亢进、急性呼吸道疾病、病毒性肝炎、慢性感染灶中，对结核菌素的敏感性增加。此外，在6岁及以下的儿童中，IA（GTH）的表达更为强烈。

在接种儿童预防性疫苗（百白破、百白破-M、艾滋病-M、麻疹、腮腺炎疫苗）后1天至10个月内进行结核菌素试验，可观察到结核菌素敏感性增加。先前的阴性反应会变为可疑阳性，并在1-2年后再次变为阴性。因此，结核菌素诊断应计划在儿童预防性疫苗接种之前进行，或不早于接种疫苗后1个月进行。

夏季结核菌素反应较不明显。在发热、肿瘤疾病、儿童病毒感染、月经期间以及使用糖皮质激素和抗组胺药治疗期间，结核菌素反应强度会降低。

在非典型分枝杆菌引起的结核菌素低敏感性普遍存在的地区，评估结核菌素试验结果可能较为困难。不同类型的分枝杆菌抗原结构存在差异，使用不同抗原时会导致不同程度的皮肤反应。在使用不同类型的结核菌素进行鉴别试验时，最明显的反应是由感染人体的分枝杆菌类型制备的结核菌素引起的。此类制剂通常称为致敏剂。

对结核菌素的阴性反应称为结核菌素无反应。原发性无反应是指未感染者对结核菌素无反应，而感染者则可能出现继发性无反应。继发性无反应又可以是阳性（作为结核病生物治疗的一种形式或免疫无反应，例如在“潜伏性微生物感染”的情况下观察到的）或阴性（在严重结核病中）。继发性无反应也见于淋巴肉芽肿病、结节病、许多急性传染病（麻疹、风疹、单核细胞增多症、百日咳、猩红热、伤寒等）、维生素缺乏症、恶病质和肿瘤。

根据大规模结核菌素检测结果，结核菌素过敏的儿童和青少年是罹患结核病风险最高的群体，需要接受结核病专科医生的全面检查。结核菌素过敏常与局部结核病的发展相关。结核菌素过敏的儿童罹患结核病的风险比正常反应的儿童高8-10倍。应特别注意感染结核分枝杆菌、出现结核菌素过敏反应以及与结核病患者接触的儿童。

在每一个体病例中，有必要研究影响结核菌素敏感性的所有因素，这对于做出诊断、选择正确的医疗策略、患者管理方法和治疗方法至关重要。

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