酶和细胞因子在骨关节炎发病机制中的作用

近年来，研究人员将大量注意力集中在鉴定导致骨关节病中关节软骨ECM降解的蛋白酶上。根据现代概念，基质金属蛋白酶（MMP）在骨关节病的发病机制中发挥着重要作用。在骨关节病患者中，检测到三种MMP水平升高——胶原酶、基质溶酶和明胶酶。胶原酶负责降解天然胶原蛋白，基质溶酶负责降解IV型胶原蛋白、蛋白聚糖和层粘连蛋白，明胶酶负责降解明胶、IV型、Vh型和XI型胶原蛋白和弹性蛋白。此外，还推测存在另一种酶——聚集蛋白聚糖酶，它具有MMP的特性，负责软骨蛋白聚糖聚集体的蛋白水解。

人类关节软骨中已鉴定出三种类型的胶原酶，其水平在骨关节炎患者中显著升高：胶原酶-1 (MMP-1)、胶原酶-2 (MMP-8) 和胶原酶-3 (MMP-13)。三种不同类型的胶原酶在关节软骨中共存表明它们各自发挥着特定的作用。事实上，胶原酶-1和-2主要位于关节软骨的浅层和中上层，而胶原酶-3则位于中下层和深层。此外，免疫组织化学研究表明，随着骨关节炎的进展，胶原酶-3的水平达到平台期甚至下降，而胶原酶-1的水平则逐渐升高。有证据表明，在骨关节炎中，胶原酶-1主要参与关节软骨的炎症过程，而胶原酶-3则参与组织重塑。胶原酶-3 在 OA 患者的软骨中表达，其降解 II 型胶原的能力比胶原酶-1 更强。

在第二组金属蛋白酶的代表中，三种基质溶素也已在人类中被鉴定：基质溶素-1 (MMP-3)、基质溶素-2 (MMP-10) 和基质溶素-3 (MMP-11)。目前已知只有基质溶素-1参与骨关节病的病理过程。在骨关节病患者的滑膜中未检测到基质溶素-2，但在类风湿性关节炎患者的滑膜成纤维细胞中发现了极少量的基质溶素-2。在类风湿性关节炎患者的滑膜中，基质溶素-3也存在于成纤维细胞附近，尤其是在纤维化区域。

在人类软骨组织中的明胶酶组中，仅鉴定出两种：92 kD 明胶酶（明胶酶 B 或 MMP-9）和 72 kD 明胶酶（明胶酶 A 或 MMP-2）；在患有骨关节炎的患者中，检测到 92 kD 明胶酶水平的增加。

最近，另一组位于细胞膜表面的MMP被鉴定出来，被称为膜型MMP（MMP-MT）。该组包含四种酶：MMP-MT1 - MMP-MT-4。MMP-MT在人类关节软骨中表达。尽管MMP-MT-1具有胶原酶特性，但MMP-MT-1和MMP-MT-2均能激活明胶酶-72 kDa和胶原酶-3。该组MMP在OA发病机制中的作用尚待阐明。

蛋白酶以酶原的形式分泌，被其他蛋白酶或有机汞化合物激活。MMP的催化活性依赖于酶活性区中锌的存在。

MMP的生物活性受特定TIMP调控。迄今为止，已鉴定出三种存在于人体关节组织中的TIMP：TIMP-1-TIMP-3。第四种TIMP已被鉴定并克隆，但尚未在人体关节组织中检测到。这些分子特异性地与MMP的活性位点结合，尽管其中一些分子能够与72 kD前明胶酶（TIMP-2、-3、-4）和92 kD前明胶酶（TIMP-1和-3）的活性位点结合。有证据表明，在OA中，关节软骨中的MMP和TIMP之间存在失衡，导致抑制剂相对缺乏，这可能部分是由于组织中活性MMP水平升高所致。TIMP-1和TIMP-2存在于关节软骨中，由软骨细胞合成。在骨关节病中，滑膜和滑液中仅检测到I型TIMP。TIMP-3仅存在于ECM中。TIMP-4与TIMP-2氨基酸序列几乎有50%相同，与TIMP-1氨基酸序列几乎有38%相同。在其他靶细胞中，TIMP-4负责调节细胞表面72 kD原明胶酶的活化，表明其作为ECM重塑的组织特异性调节剂发挥着重要作用。

控制MMP生物活性的另一种机制是其生理性活化。目前认为，丝氨酸蛋白酶家族中的酶（例如AP/纤溶酶和半胱氨酸蛋白酶B）是MMP的生理性激活剂。在骨关节炎患者的关节软骨中，尿激酶(uAP)和纤溶酶的水平有所升高。

尽管在关节组织中发现了几种类型的组织蛋白酶，但组织蛋白酶-B被认为是软骨中MMPs最可能的激活剂。在人体关节组织中发现了丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的生理抑制剂。在骨关节炎患者中，AP-1抑制剂（IAI-1）以及半胱氨酸蛋白酶的活性降低。与MMP/TIMP类似，丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂之间的不平衡可以解释骨关节炎患者关节软骨中MMPs活性的增加。此外，MMPs能够相互激活。例如，基质溶解素-1激活胶原酶-1、胶原酶-3和92 kD明胶酶；胶原酶-3激活92 kD明胶酶； MMP-MT 激活胶原酶-3，而明胶酶-72 kDa 增强此激活作用；MMP-MT 也激活明胶酶 72 kDa。细胞因子可分为三类：破坏性（炎症）、调节性（包括抗炎）和合成代谢性（生长因子）。

细胞因子的类型（根据 van den Berg WB 等人的观点）

破坏性的	白细胞介素-1 肿瘤坏死因子-a 白血病抑制因子 白细胞介素-17
监管	白细胞介素-4 白细胞介素-10 白细胞介素-13 酶抑制剂
合成代谢	胰岛素样生长因子 TGF-b 骨形态发生蛋白 源自软骨的形态发生蛋白

破坏性细胞因子，尤其是IL-1，会诱导蛋白酶释放增加，并抑制软骨细胞合成蛋白聚糖和胶原蛋白。调节性细胞因子，尤其是IL-4和IL-10，会抑制IL-1的产生，增加IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）的产生，并降低软骨细胞中NO合酶的水平。因此，IL-4从三个方面对抗IL-1：1）减少IL-1的产生，阻止其作用；2）增加主要“清道夫”IL-1RA的产生；3）减少主要次级“信使”NO的产生。此外，IL-4还能降低组织的酶促降解。在体内，IL-4和IL-10联合使用可达到最佳治疗效果。 TGF-β和IGF-1等合成代谢因子实际上并不干扰IL-1的产生或作用，而是表现出相反的活性，例如刺激蛋白聚糖和胶原蛋白的合成，抑制蛋白酶的活性，而且TGF-β还抑制酶的释放并刺激其抑制剂。

促炎细胞因子负责增加关节组织中基质金属蛋白酶（MMP）的合成和表达。它们在滑膜中合成，然后通过滑液扩散到关节软骨中。促炎细胞因子激活软骨细胞，而软骨细胞又能够产生促炎细胞因子。在受骨关节病影响的关节中，炎症的效应细胞主要由滑膜细胞发挥。巨噬细胞型滑膜细胞分泌蛋白酶和炎症介质。其中，IL-f、TNF-a、IL-6、白血病抑制因子（LIF）和IL-17与骨关节病的发病机制密切相关。

刺激骨关节炎关节软骨退化的生物活性物质

• 白细胞介素-1
• 白细胞介素-3
• 白细胞介素-4
• 肿瘤坏死因子-a
• 集落刺激因子：巨噬细胞（单核细胞）和粒细胞-巨噬细胞
• P物质
• 前列腺素_E2
• 纤溶酶原激活剂（组织型和尿激酶型）和纤溶酶
• 金属蛋白酶（胶原酶、蛋白酶、溶基质酶）
• 组织蛋白酶A和B
• 特里尔辛
• 细菌脂多糖
• 磷脂酶抗原

文献资料表明，IL-1 和可能的 TNF-a 是骨关节病中关节组织破坏的主要介质。然而，它们是否彼此独立作用或它们之间是否存在功能层次仍不得而知。骨关节病动物模型显示，IL-1 阻断可有效防止关节软骨破坏，而 TNF-a 阻断仅导致关节组织炎症减少。在患者的滑膜、滑液和软骨中均发现这两种细胞因子的浓度升高。在软骨细胞中，它们不仅能够增加蛋白酶（主要是 MMP 和 AP）的合成，还能增加次要胶原蛋白（例如 I 型和 III 型）的合成，并减少 II 型和 IX 型胶原蛋白和蛋白聚糖的合成。这些细胞因子还能刺激活性氧和炎症介质（例如 PGE _{2 ）}。骨关节炎中关节软骨的大分子变化导致修复过程无效，从而导致软骨进一步退化。

上述促炎细胞因子调节骨关节病中MMP的抑制/激活过程。例如，骨关节病软骨中TIMP-1和MMP水平的失衡可能由IL-1介导，因为体外研究表明，IL-1β浓度升高会导致TIMP-1浓度降低，软骨细胞MMP合成增加。AP合成也受IL-1β调节。体外用IL-1刺激关节软骨细胞，会导致AP合成呈剂量依赖性增加，而iAP-1合成急剧下降。IL-1降低iAP-1合成和刺激AP合成的能力是纤溶酶生成和MMP激活的有效机制。此外，纤溶酶不仅是一种激活其他酶的酶，它还通过直接蛋白水解参与软骨降解过程。

IL-ip 合成时为分子量为 31 kD 的无活性前体（前 IL-ip），信号肽裂解后转化为分子量为 17.5 kD 的活性细胞因子。在关节组织中，包括滑膜、滑液和关节软骨，IL-ip 以活性形式存在，体内研究表明骨关节病的滑膜能够分泌这种细胞因子。一些丝氨酸蛋白酶能够将前 IL-ip 转化为其生物活性形式。在哺乳动物中，只有一种蛋白酶具有这种特性，它属于半胱氨酸天冬氨酸特异性酶家族，被称为 IL-1β 转化酶（ICF，或 caspase-1）。这种酶能够特异性地将前 IL-ip 转化为具有生物活性的“成熟”IL-ip，分子量为 17.5 kD。 ICF是一种位于细胞膜上的45 kD酶原（p45）。p45酶原经蛋白酶水解后，形成两个亚基，分别称为p10和p20，这两个亚基均具有酶活性。

TNF-α也以膜结合前体的形式合成，其分子量为26 kDa；通过蛋白水解酶切，它以活性可溶形式从细胞中释放出来，分子量为17 kDa。蛋白水解酶切由TNF-α转化酶（TNF-AC）进行，该酶属于阿达木林家族。AR Amin等人（1997）发现骨关节炎患者关节软骨中TNF-AC mRNA表达增加。

IL-1 和 TNF-a 对软骨细胞和滑膜细胞的生物激活作用是通过与细胞表面的特定受体 IL-R 和 TNF-R 结合介导的。每种细胞因子均已鉴定出两种受体：IL-IP I 型和 II 型以及 TNF-R I 型 (p55) 和 II 型 (p75)。IL-1PI 和 p55 负责关节组织细胞中的信号传递。IL-1R I 型对 IL-1β 的亲和力略高于 IL-1a；相反，IL-1R II 型对 IL-1a 的亲和力高于 IL-1ip。尚不清楚IL-IP II型是否能够介导IL-1信号，还是仅仅竞争性地抑制IL-1与IL-1R I型的结合。骨关节病患者的软骨组织和滑膜成纤维细胞含有大量的IL-1PI和p55，这反过来解释了这些细胞对相应细胞因子刺激的高度敏感性。这一过程导致蛋白水解酶分泌增加和关节软骨破坏。

IL-6参与骨关节炎的病理过程不能排除。该假设基于以下观察结果：

• IL-6 增加滑膜中炎症细胞的数量，
• IL-6 刺激软骨细胞增殖，
• IL-6 增强 IL-1 增加 MMP 合成和抑制蛋白多糖合成的作用。

但IL-6能够诱导TIMP的产生，但不影响MMP的产生，因此认为该细胞因子参与抑制关节软骨蛋白水解降解的过程，该过程通过反馈机制进行。

IL-6 家族的另一个成员是 LIF，它是由骨关节病患者的软骨细胞在促炎细胞因子 IL-1p 和 TNF-a 的刺激下产生的细胞因子。LIF 刺激软骨蛋白聚糖的吸收、MMP 的合成和 NO 的产生。该细胞因子在骨关节病中的作用尚未完全阐明。

IL-17 是一个分子量为 20-30 kD 的同型二聚体，具有类似 IL-1 的作用，但作用不如 IL-1 明显。IL-17 刺激靶细胞（例如人类巨噬细胞）合成和释放多种促炎细胞因子，包括 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 MMP。此外，IL-17 还能刺激软骨细胞产生 NO。与 LIF 类似，IL-17 在骨关节炎 (OA) 发病机制中的作用研究较少。

无机自由基NO在OA关节软骨的降解中起着重要作用。与正常细胞相比，从骨关节炎患者体内分离的软骨细胞无论是自发产生还是在促炎细胞因子刺激后，都会产生更高的NO。在骨关节炎患者的滑液和血清中发现了较高的NO含量，这是由于诱导NO合酶（hNOC）的表达和合成增加所致，hNOC是负责NO生成的酶。最近，软骨细胞特异性hNOC的DNA被克隆，并确定了该酶的氨基酸序列。该氨基酸序列与内皮和神经组织特异性hNOC有50%的同源性和70%的相似性。

NO抑制关节软骨细胞外基质（ECM）大分子的合成，并刺激基质金属蛋白酶（MMP）的合成。此外，NO生成增加会伴随软骨细胞IL-IP拮抗剂（IL-1RA）合成减少。因此，IL-1水平升高和IL-1RA水平降低会导致软骨细胞中NO过度刺激，进而导致软骨基质降解加剧。已有报道显示，选择性hNOC抑制剂在体内对实验性骨关节病进展具有治疗作用。

天然细胞因子抑制剂能够直接阻止细胞因子与细胞膜受体结合，从而降低其促炎活性。根据作用机制，天然细胞因子抑制剂可分为三类。

第一类抑制剂包括受体拮抗剂，它们通过竞争结合位点来阻止配体与其受体的结合。迄今为止，此类抑制剂仅发现于IL-1——即上文提到的IL-1/ILIP系统竞争性抑制剂IL-1 PA。IL-1 PA可以阻断骨关节炎关节组织中观察到的许多效应，包括滑膜细胞合成前列腺素、软骨细胞产生胶原酶以及关节软骨基质的降解。

IL-1RA 有多种形式：一种是可溶性 IL-1RA（rIL-1RA），两种是胞内 IL-1RA（μIL-lPAI 和 μIL-1RAP）。可溶性 IL-1RA 的亲和力比胞内 IL-1RA 高 5 倍。尽管已进行了大量科学研究，但胞内 IL-1RA 的功能仍然未知。体外实验表明，抑制 IL-1β 活性需要 IL-1RA 浓度比正常浓度高 10 至 100 倍，而体内实验则需要 IL-1RA 浓度增加数千倍。这一事实可能部分解释了骨关节病患者滑膜中 IL-1RA 相对缺乏而 IL-1 过量的情况。

第二类天然细胞因子抑制剂是可溶性细胞因子受体。与骨关节炎发病机制相关的人类此类抑制剂的例子包括rIL-1R和pp55。可溶性细胞因子受体是正常受体的缩短形式；当它们与细胞因子结合时，它们通过竞争性拮抗机制阻止细胞因子与靶细胞的膜相关受体结合。

可溶性受体的主要前体是膜结合型IL-1RP。rIL-IP对IL-1和IL-1RA的亲和力不同，rIL-1RN对IL-1β的亲和力高于IL-1RA，rIL-1PI对IL-1RA的亲和力高于IL-ip。

TNF 也有两种可溶性受体——pp55 和 pp75，与可溶性 IL-1 受体类似，它们通过“脱落”形成。在体内，这两种受体都存在于受累关节的组织中。可溶性 TNF 受体在骨关节病发病机制中的作用尚有争议。据推测，低浓度时，它们可以稳定 TNF 的三维结构并延长这种生物活性细胞因子的半衰期；而高浓度的 pp55 和 pp75 则可以通过竞争性拮抗作用降低 TNF 活性。pp75 可能作为 TNF 载体，促进其与膜相关受体结合。

第三类天然细胞因子抑制剂以一组抗炎细胞因子为代表，包括TGF-β、IL-4、IL-10和IL-13。抗炎细胞因子可减少促炎因子和某些蛋白酶的产生，并刺激IL-1RA和TIMP的产生。