诊断遗传性疾病的分子遗传学方法

DNA技术方法用于确定突变基因在特定染色体上的定位，这些基因是某些遗传性疾病的起源。由于基因是DNA的一部分，而基因突变是指DNA一级结构的破坏（突变是指DNA序列的所有变化，无论其位置如何以及是否对个体生存能力产生影响），因此，通过探测遗传性疾病患者的中期染色体制剂，可以确定致病基因的位置。分子遗传学方法为在DNA结构改变的层面上诊断疾病创造了机会，使我们能够确定遗传性疾病的位置。分子遗传学方法可以识别与单个碱基替换相关的突变。

基因鉴定最重要的阶段是基因分离。DNA可以从任何类型的含细胞核的组织和细胞中分离。DNA分离的步骤包括：快速裂解细胞；通过离心去除细胞器和细胞膜碎片；酶解蛋白质并用苯酚和氯仿从溶液中提取蛋白质；以及通过乙醇沉淀浓缩DNA分子。

在遗传实验室中，DNA通常是从血液白细胞中分离出来的，具体方法是从患者身上抽取5-20毫升静脉血，放入装有抗凝剂（肝素）的无菌试管中。然后，按照上述步骤分离并处理白细胞。

制备研究材料的下一阶段是将DNA在具有严格特定碱基序列的区域“切割”成片段，这需要使用细菌酶——限制性内切酶（限制性内切酶）。限制性内切酶识别双链DNA分子中4-6个核苷酸（较少见，8-12个核苷酸）的特定序列，并在这些序列的位置（称为限制性位点）将其切割成片段。产生的DNA限制性片段的数量取决于限制性位点出现的频率，而片段的大小则取决于这些位点沿原始DNA分子长度的分布情况。限制性位点出现的频率越高，限制性内切酶切割后的DNA片段就越短。目前，已知的细菌来源的限制性内切酶超过500种，每种酶都能识别其特定的核苷酸序列。未来，限制性位点可以作为DNA的遗传标记。限制性内切酶切位点（DNA）可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳按长度排序，从而确定其分子量。通常，凝胶中的DNA通过特异性染色（通常为溴化乙锭）并在透射紫外光下观察凝胶来识别。DNA定位位点被染成红色。然而，在人类中，当DNA被几种限制性内切酶处理时，会形成许多长度不一的片段，以至于无法通过电泳分离，也就是说，无法在电泳图上目视识别单个DNA片段（凝胶的整个长度上染色均匀）。因此，为了在这种凝胶中识别所需的DNA片段，需要使用标记DNA探针的杂交方法。

任何单链 DNA 或 RNA 片段都能与互补链结合（杂交），其中鸟嘌呤总是与胞嘧啶结合，腺嘌呤总是与胸腺嘧啶结合。双链分子就是这样形成的。如果用放射性标记物标记克隆基因的单链拷贝，就会得到一个探针。该探针能够找到互补的 DNA 片段，然后使用放射自显影技术轻松识别。将放射性探针添加到拉伸染色体制剂中，可以将基因定位在特定的染色体上：使用 DNA 探针可以在南方印迹法中识别特定区域。如果被检测的 DNA 片段包含正常基因，就会发生杂交。如果存在异常核苷酸序列，即相应的染色体结构包含突变基因，则不会发生杂交，从而可以确定病理基因的定位。

为了获取DNA探针，人们使用基因克隆方法。该方法的本质是将与某个基因或基因片段相对应的DNA片段插入克隆颗粒，通常是细菌质粒（存在于细菌细胞中，携带抗生素抗性基因的环状染色体外DNA），然后将携带插入人类基因的质粒的细菌进行增殖。由于质粒中的合成过程，可以获得数十亿个人类基因或其片段的拷贝。

然后将得到的 DNA 拷贝用放射性标记或荧光染料标记，用作探针在所研究的 DNA 分子池中寻找互补序列。

目前，利用DNA探针诊断基因突变的方法有很多种。

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