一瓶两靶：基于 CRISPR 的便携式结核病诊断，灵敏度高达 100%

《科学进展》杂志发表了一篇关于便携式结核病检测的论文，该检测无需复杂设备，直接从痰液中进行。恒温 DNA 扩增和 CRISPR 读取结合在一个试管中；同时检测两个保守的结核分枝杆菌插入（IS6110 和 IS1081），另加一个人类基因作为内部样本对照。在对临床样本进行的小规模“盲测”中，与培养相比，该检测的灵敏度为 100%（6/6），特异性为 100%（7/7）；在模拟痰液中的检测限约为 69-81 CFU/ml。结果可在纸质试纸上查看，试剂为冻干品（无需“冷链”储存）。

背景

据世界卫生组织估计，2023年结核病将导致约125万人死亡；结核病已再次成为全球最大的传染病死因，预计病例数达1080万。这使得便捷快速的诊断方法至关重要，尤其是在资源匮乏的地区。

• 目前的检测方法在准确性、速度和价格之间寻求平衡。“金标准”细菌培养非常准确，但速度慢；显微镜检查速度快，但不灵敏；Xpert MTB/RIF Ultra 等 PCR 平台的灵敏度明显更高（LOD ≈ 15.6 CFU/ml），但需要昂贵的设备和试剂盒，这限制了检测范围。
• 为什么选择恒温和 CRISPR？恒温 RPA 扩增可在 37–42 °C 下进行，无需热循环仪——非常方便“现场”操作。CRISPR 读取 (Cas12/13) 可增强物种特异性，并允许可视化横向流动（“条带”），无需复杂的光学元件。总而言之，这是实现便携式且经济实惠的 PVR 检测的途径。
• 为什么同时检测两个MBT靶点（IS6110 + IS1081）。IS6110是结核分枝杆菌复合体的一个多拷贝插入片段，但有些细胞株的拷贝数很少，单独检测IS6110可能会“漏检”。添加第二个IS1081插入片段可以降低假阴性结果的风险。
• 为何需要内部人为对照。呼气样本可能含有抑制剂和“坏”样本。内源性人为对照（例如 RNase P/基因组 DNA）可确认材料充足且反应未受到抑制——否则结果不能视为阴性。
• 一锅法本身就很重要。它减少了步骤，降低了污染风险，并方便了实验室外的工作。这种方法在结核病治疗中已经显示出可行性；这项新研究将这一理念扩展为具有内部对照的双靶点方案，并演示了试剂的冻干和试纸条读取器。
• 这篇文章的价值是什么？作者证明了，只需最简化的样本制备，即可直接从痰液中进行检测，模拟痰液的检测限约为70-80 CFU/ml，并且在小盲临床样本中达到100%的灵敏度/特异性——这为进一步的多中心验证提供了一个很好的“技术演示”。

这是如何运作的

• 科学家们将 RPA（37°C 快速等温扩增遗传物质）与“切割”酶 Cas13a/Cas12a 相结合。在选定向导 RNA 后，他们将系统配置为同时靶向两个 MBT 靶标，并与人类 DNA 并行（检查样本中是否存在物质，以及反应是否“停滞”）。
• 所有化学反应都集中在一个试管中进行；孵育后，可以用荧光计或侧流试纸读取结果——本质上就像快速测试。
• 痰液处理已简化为加热和短暂离心，无需核酸提取仪。对于最有限的条件，作者甚至讨论了手动离心的替代方案。

测试结果

• 检测限：在“尖峰”痰液中，69.0 CFU/ml（H37Rv菌株）和80.5 CFU/ml（BCG）。未检测到与其他细菌/真菌的交叉反应。
• 临床环境（盲样）：13个实际临床样本：接种后灵敏度为100%（6/6），特异性为100%（7/7）。相比之下，GeneXpert Ultra在同一试剂盒上分别显示100%/86%的灵敏度和特异性。
• 技术细节：在两种读取方案中，Cas13a 的效果更好（对于“一锅法”方案，它比 Cas12a 更灵敏）。此外，同时检测两个 MTB 靶点可以降低出现错误结果的风险。

为什么这是必要的？

目前的检测方法在准确性、速度和可用性之间寻求平衡：培养法非常准确但速度慢；拭子法快速但不准确；像 GeneXpert 这样的 PCR 系统准确且快速，但需要昂贵的仪器和试剂盒。新的 CRISPR 方法旨在弥补这一差距：可在 37°C 下进行现场诊断，使用纸条读数，并且无需冷藏即可储存试剂。

局限性和下一步

这是在小型临床设备上进行的早期演示——未来需要进行大规模、多中心的测试（包括儿童HIV合并感染、少菌型和不同MBT谱系）。作者们另行指出，在“现场”版本中，台式离心机必须替换为完全手动的解决方案。但该架构本身——“双靶+内参”在一个试管中——已经证明了其可操作性，并为大规模应用的改进提供了清晰的路径。

来源：Alexandra G. Bell 等人，《一种基于 CRISPR 的简化痰液结核病检测方法》，《科学进展》，2025 年 8 月 6 日在线发表（第 11 卷，第 32 期）。DOI ：10.1126/sciadv.adx206