结核病的实验室诊断

结核病是一种在现代科学条件下较易诊断的疾病，其实验室诊断在结核病的诊断方法中占有重要地位，仅次于X射线检查。

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临床血液检查

结核病患者的一般血液检查结果并非特异的。局限性和低活动性结核病的特征性表现是红细胞数量正常但低色素沉着。大面积浸润或干酪性肺炎，伴有广泛的干酪性淋巴结炎、特异性肠道损害以及肺大出血或术后出血时，可出现红细胞减少、小细胞增多、少色素沉着和多色素沉着。大细胞增多症，尤其是异色红细胞增多症，较少见，通常伴有严重贫血。结核病代偿期网织红细胞数量为0.1%至0.6%，亚代偿期为0.6%至1.0%，失代偿期网织红细胞数量为1%为特征。

在某些结核病病例中，可以观察到中度白细胞增多（高达15,000个白细胞），较少出现白细胞减少症，在患有有限和轻度结核病的患者中发生率为2-7％，在破坏性和进行性肺结核中发生率为12.5％。

最常见的是白细胞计数的改变。可观察到相对和绝对中性粒细胞增多，白细胞计数左移至早幼粒细胞。在无并发症的结核病病例中，很少见到中幼粒细胞。结核病患者血象中病理性颗粒状中性粒细胞数量的增加通常提示病情的持续：重症结核病患者几乎所有中性粒细胞都呈病理性颗粒状。结核病发作消退后，核移位会相对较快地恢复正常。中性粒细胞的病理性颗粒状通常比血象中的其他变化持续时间更长。

外周血中嗜酸性粒细胞的含量也会根据病程和机体的过敏状态而波动。在严重且持续的疾病发作中，嗜酸性粒细胞数量会降低至嗜酸性粒细胞增多；相反，在浸润液和胸腔积液吸收过程中，以及在原发性结核病的早期阶段，嗜酸性粒细胞数量会增加。

大多数原发性结核病都伴有淋巴细胞减少，有时即使在特定病变形成瘢痕后仍会持续数年。继发性结核病在急性期，根据病情严重程度，可能伴有淋巴细胞数量正常或淋巴细胞减少。

在评估结核病进程的测试中，测定红细胞沉降率（ESR）占有特殊地位，其在评估结核病进程和识别其活动形式方面非常重要。ESR 增加表明存在病理过程（感染性和炎症性、化脓性、败血性、血母细胞病、淋巴肉芽肿病等）并可作为其严重程度的指标，但正常的 ESR 值并不总是表示没有病理。血液中球蛋白、纤维蛋白原、胆固醇含量的增加以及血液粘度的降低有助于加速红细胞沉降。红细胞沉降减慢是伴有血液浓缩、白蛋白和胆汁酸含量增加的特征。

结核病患者的血象在治疗过程中会发生变化。治疗干预越成功，血液学改变消失得越快。同时，应注意各种抗菌药物对造血的影响。这些药物常引起嗜酸性粒细胞增多，有时甚至引起白细胞增多，更常见的是白细胞减少，直至粒细胞缺乏和淋巴网状反应。系统地监测血液学并正确分析所得数据，对于评估患者的临床状况、病情发展动态和治疗效果至关重要。

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临床尿液分析

尿路结核的实验室诊断以尿液分析为主，可出现白细胞尿、红细胞尿、蛋白尿、低等渗性尿、结核分枝杆菌尿、非特异性菌尿等。

白细胞尿是泌尿道结核在特定化疗前最常见的症状，仅在特殊情况下才会消失，例如输尿管管腔完全闭塞。Nechiporenko 试验（测定 1 毫升尿液中的白细胞数量）有助于更客观地评估肾结核的白细胞尿程度，在某些情况下，甚至可以通过正常的尿液常规分析检测出来。然而，需要注意的是，白细胞尿可能发生于急性和慢性肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎、肾结石和输尿管疾病中。

红细胞尿与白细胞尿一样，被认为是泌尿生殖系统结核最常见的实验室体征之一。血尿的发生率取决于结核病的严重程度；随着肾脏破坏性结核病灶的进展，血尿的发生率也会增加。红细胞尿伴白细胞尿在肾结核早期更为常见。血尿多于白细胞尿，是肾结核与非特异性肾盂肾炎鉴别诊断的重要依据。

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生化血液检查

在结核病中，某些生化指标的变化主要取决于病程、并发症和各种伴随疾病。在肺和其他器官的非活动性结核病患者中，血清总蛋白和蛋白质级分没有变化，并决定了它们的正常含量。

在疾病的急性形式中以及在慢性结核病的加重和进展中，白蛋白-球蛋白系数会降低。

测定血清中的直接胆红素、总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 和丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 对评估结核病及其并发症患者的肝脏功能状态和器质性损害具有重要意义。在结核病患者（尤其是重症患者）治疗中，动态测定氨基转移酶和胆红素水平是结核病患者生化检查的必测项目，每月进行一次。

肾脏功能状态的评估包括测定血清肌酐水平，并使用Cockcroft-Gault公式计算肾小球滤过率。使用Reberg试验计算肾小球滤过率的结果准确性较低。

结核病患者动态生化研究的主要目的是监测病程，及时发现药物的副作用并充分纠正新出现的稳态紊乱。

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生化研究方法在肺外结核中的应用

最具参考价值的指标被认为是生物体液中的结核硬脂酸含量，但其测定存在技术困难（需要使用气相色谱法和质谱法）。

腺苷脱氨酶是一种在滑膜、心包、腹水或脑脊液中检测的酶，其活性测定前景广阔。腺苷脱氨酶的主要产生者是淋巴细胞和单核细胞。测定生物体液中腺苷脱氨酶的活性有助于诊断结核性滑膜炎、淋巴结结核、结核性脑膜炎和结核性浆膜炎。

一些生化指标由于其非特异性，仅在病变附近的体液中检测。指标水平是在皮下或皮内注射结核菌素后测量的（通常在注射前以及注射后48小时和72小时）。此后，根据初始水平计算标志物水平的升高幅度（以百分比表示）。

最佳方法是测定尿液中器官特异性酶转氨酶的活性；其出现于各种原因的肾脏损害中。只有在皮下注射结核菌素以加剧局部炎症过程的情况下，才有必要检测转氨酶活性。在注射50微克/千卡培他滨结核菌素后，以及注射24-72小时内，应在尿液中测定转氨酶活性。在82%的病例中，尿液中发酵尿液增加2倍或更多，可以区分活动性肾脏结核和慢性肾盂肾炎加重。

对于女性生殖器官结核病，应在激发结核菌素试验条件下测定血液中的结合珠蛋白和丙二醛浓度。结核菌素皮下注射剂量为50 TE，并在72小时后重复进行生化检查。对于结核病因，结合珠蛋白水平升高程度至少为28%，丙二醛水平升高程度至少为39%。还应测定从道格拉斯囊获得的腹膜液中腺苷脱氨酶的活性。在皮下注射0.1 TE和0.01 TE剂量的结核菌素72小时后，再次检查内生殖器官在腹壁前部投影区域的穿刺情况。腺苷脱氨酶活性较初始值增加10%或以上，提示有结核病灶。

如果出现眼部损伤，则需检查眼部在抗原刺激下发生的局部反应。在这种情况下，出现剧烈反应并伴有视觉功能下降的情况是不可取的。由于评估微小局部反应通常较为困难，建议同时关注血清中结合珠蛋白或腺苷脱氨酶的升高程度，以使结论更加客观。

一切生化研究都应与其他方法结合进行。

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血液凝固系统研究

研究凝血系统状态在肺结核病学中的重要性在于，许多肺结核患者会出现咯血或肺出血，以及结核病外科治疗中出现的凝血并发症。此外，自然伴随的潜在血管内凝血会影响疾病的进程和化疗的效果。

在以渗出性炎症成分为主的肺结核患者中，血液抗凝活性会降低。在特异性肺损伤发生率较低且以生成性炎症成分为主的患者中，血管内血液凝固表现不明显。在伴有咯血和肺出血的肺结核患者中，血液凝固系统的状态有所不同：在出血高峰期或止血后立即出现少量失血的患者中，由于凝血酶形成过程明显增强，同时保持较高的“结构性”凝血能力，血液凝固能力会急剧增加。在大量失血的患者中，由于纤维蛋白原浓度、XIII因子活性和血小板计数下降，血液凝固能力会降低。局限性肺结核患者在手术治疗阶段，稳态系统尚无明显紊乱。对于广泛性病变患者，在进行全肺切除术或胸膜肺切除术时，常出现DIC综合征，可作为“继发性疾病”。

监测肺结核患者的凝血系统状态，需测定活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原、凝血酶时间、凝血酶原指数，以及出血时间、凝血时间。

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激素研究

现代实验和临床观察表明，在特定的肺部结核性炎症中存在激素状态的变化。已证明，纠正垂体-肾上腺系统、垂体-甲状腺系统和胰腺功能障碍，并结合抗结核治疗，有助于激活特定炎症病灶中的纤维化和修复过程。

垂体-甲状腺系统的功能状态通过血清中三碘甲状腺原氨酸 (T3)、甲状腺素 (T4) 和垂体促甲状腺激素 (TSH) 的含量来判断_。已_证实，38%-45% 的肺结核患者可检测到亚临床甲状腺功能减退症，并且最常诊断为播散型和纤维海绵状结核。在这些类型中，T3 和 T4 水平下降最为显著_，并且这些激素的_{失衡表现为 T4/} T3_比率的升高。

肾上腺皮质的功能通过血清皮质醇水平来评估，胰腺的内分泌功能通过免疫反应性胰岛素的浓度来评估。在传染病的急性期，对内源性皮质醇和胰岛素的需求增加。高胰岛素血症也表明身体组织存在胰岛素抵抗，这在任何活动性炎症过程，特别是特定炎症过程中都是典型的。测定活动性肺结核患者的肾上腺糖皮质激素功能使我们能够检测出大多数患者的皮质醇增多症。急性期感染性炎症患者的正常血液皮质醇浓度应被视为肾上腺皮质糖皮质激素功能相对不足，这可以作为使用足量糖皮质激素进行替代疗法的依据。

近三分之一的肺结核患者胰岛素血症水平较低，接近正常下限，而13-20%的患者则患有严重的高胰岛素血症。相对低胰岛素血症和高胰岛素血症都是导致不同严重程度碳水化合物代谢紊乱的高危因素。胰腺B细胞功能活动的这些变化需要结核病患者定期监测血糖，并及时预防糖尿病。此外，这也进一步证明了在结核病综合治疗中使用生理剂量胰岛素的合理性。

一般而言，甲状腺激素水平下降、失衡、高皮质醇血症和高胰岛素血症在结核病程严重、肺部病变广泛和结核中毒症状明显的患者中最为明显。

结核病的微生物学诊断

微生物学研究对于识别结核病患者、确认诊断、监测和调整化疗、评估治疗结果都是必要的，换句话说，从结核病患者登记到从登记册上除名，都需要进行微生物学研究。

所有流行病学项目和计划都以评估排菌者的数量为基础，而这离不开实验室检测结核分枝杆菌的方法。在调查所谓的无组织人群的吸引力时，排菌者的比例高达70%甚至更高，这使得实验室方法成为在该人群中识别结核病患者的相当有效的手段。

传统的结核病微生物学诊断方法是细菌镜检和细菌培养。现代方法包括自动化系统培养结核分枝杆菌和PCR。然而，所有这些方法都必须与传统的细菌学方法相结合。

诊断材料的收集

实验室检测的有效性很大程度上取决于诊断材料的质量。遵守诊断材料的采集、储存和运输规则，以及精确执行患者检查程序，直接影响检测结果并确保生物安全。

用于检测结核病的材料多种多样。由于肺结核是最常见的结核感染形式，因此主要检测材料被认为是痰液和其他类型的气管支气管树分泌物：气雾吸入后获得的上呼吸道分泌物：支气管灌洗液；支气管肺泡灌洗液；支气管镜检查、经气管和肺内活检中获得的材料：支气管抽吸物、喉涂片、渗出液、伤口涂片等。

如果能对患者样本进行有控制的采集，研究效果将得到提升。为此，我们会配备专门的房间或购买专用的隔间。样本采集过程十分危险，因此，必须按照感染安全规定采集用于研究的样本。

用于检测结核分枝杆菌的材料被收集在带有旋紧盖的无菌小瓶中，以防止环境污染并保护收集的材料免受污染。

用于收集诊断材料的小瓶必须满足以下要求：

• 必须由抗冲击材料制成；
• 高压灭菌时应容易融化；
• 具有足够的体积（40-50毫升）：
• 具有较宽的收集痰液的开口（直径不小于30毫米）；
• 易于操作、透明或半透明，以便无需打开盖子即可评估所收集样本的数量和质量。

为了获得最佳研究结果，必须满足以下条件：

• 材料的收集应在化疗开始前进行；
• 研究材料必须在早晨进食或服药前收集；
• 为了进行研究，建议收集至少3个早晨痰液样本。痰液收集连续3天；
• 收集到的材料必须尽快送达实验室：
• 如果无法立即将材料送至实验室，则应将其存放在空气温度为 4°C 的冰箱中，存放时间不得超过 48 小时；
• 在运输物料时，要特别注意瓶子的完整性。

正确采集的痰液呈粘液或粘脓性。痰液检查部分的最佳量为3-5毫升。

痰液采集需在医护人员的监督下进行。负责采集痰液的人员必须确保遵守以下规定：

• 有必要向患者解释检查目的，并说明咳出的不是唾液或鼻咽黏液，而是呼吸道深层的内容物。可以通过几次（2-3次）深呼吸后伴有痰液的咳嗽来达到这一目的。还需告知患者，必须先用开水漱口，以清除口腔内的主要菌群和食物残渣，因为这些菌群和残渣会影响痰液检查。
• 参与采集痰液的医务人员，除穿隔离衣、戴帽子外，还必须佩戴口罩、橡胶手套、橡胶围裙；
• 站在病人身后，建议他将药瓶尽可能靠近嘴唇，并在病人咳出痰液时立即将痰液分入药瓶中，同时必须确保气流远离医护人员：
• 痰液采集完成后，医护人员应小心盖好瓶盖，并评估采集痰液的数量和质量。之后，将痰液瓶贴上标签，放入专用盒子中，以便运送至实验室。

如果患者无痰，则应在痰液采集前一天晚上和采集当天清晨给予祛痰药：药蜀葵根提取物（Mucaltin）、溴己新、氨溴索等，或使用刺激性吸入剂，并使用痰液采集室的设备。以此方式采集的痰液无需保存，应在采集当天进行检查。为避免其在实验室中被“拒收”，应在转诊单中特别注明。

如果微生物学研究不在指定机构进行，则必须将收集的诊断材料集中送至实验室，但两次送检之间必须冷藏或添加防腐剂。材料将使用易于消毒的运输箱送至实验室。每个样本必须贴上相应的标签，整批样本必须附有完整的随附表格。

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患者检查方式和频率

在对患者进行初步的、所谓的诊断性结核病检查时，需要在医务人员的监督下，在 2 或 3 天内检查至少 3 份痰液，这会增加显微镜检查的有效性。

卫生系统内的所有医疗和诊断机构都应开展结核病的初步筛查。近年来，为了提高初步检查的有效性，在临床诊断实验室的基础上组建了所谓的显微镜中心，配备了现代化的显微镜和设备，以确保疫情安全。

抗结核病机构采用的调查方案规定，患者在3天内至少进行3次痰液或其他诊断性物质检查。在治疗期间，强化化疗阶段应定期进行微生物学检查，每月至少一次。进入随访阶段后，检查频率降低，间隔2-3个月，直至检查频率降至两次。

肺外结核诊断材料的采集特点

肺外结核病病理材料的特点是其中结核分枝杆菌的浓度低，这需要更敏感的微生物学研究方法，主要是在营养培养基上播种的方法。

对于泌尿生殖系统结核，尿液是最容易获取的检查材料。尿液采集应由经过专门培训的护士进行。

外生殖器用肥皂水或高锰酸钾稀溶液清洗。尿道外口需仔细处理。晨尿中段用无菌瓶收集：男性使用导尿管，女性则使用导尿管。肾盂尿液在单侧或双侧肾脏插管时收集于无菌试管中，双侧肾脏需分别插管。取少量尿液离心，检测沉淀物。

在男性中，精子、睾丸穿刺物和前列腺分泌物会被离心分离，以获得沉淀物。当男性生殖器区域出现任何特定病变时，前列腺按摩可以促进含有结核分枝杆菌的分泌物的释放。

通过抽吸或卡夫卡帽采集女性经血。用蒸馏水冲洗后离心，除去红细胞。对沉淀物进行检测。

将宫颈管排出的分泌物收集在某个容器或卡夫卡帽中，最好积累1-2毫升病理物质。

将肾脏、生殖器、活检组织、子宫内膜刮取物等外科手术过程中获取的材料进行均质处理。将材料置于无菌研钵中，用无菌剪刀彻底粉碎。将等量无菌河砂加入所得悬浮液中，然后加入0.5-1.0毫升等渗氯化钠溶液，研磨至糊状，再加入4-5毫升等渗氯化钠溶液。静置1-1.5分钟，取上清液进行检测。

骨和关节结核。用无菌注射器抽取脓液（脓肿脓液），置于无菌容器中，立即送至实验室。用事先用无菌等渗氯化钠溶液润湿的无菌吸量管吸取2-5毫升脓液，移入带珠子的瓶子中，再加入2-3毫升等渗氯化钠溶液。用塞子盖好瓶子，在摇床上摇晃8-10分钟。检测均质后的悬浮液。

对于瘘管型骨关节结核，需从瘘管中抽取脓液。如果脓液量充足，则直接收集至试管中。如果脓液量较少，则用无菌等渗氯化钠溶液冲洗瘘管，并将冲洗液收集至试管中或用浸有脓液的棉球中送检。

骨关节外科手术中获得的手术材料可能包括化脓性坏死肿块、肉芽组织、瘢痕组织、骨组织、滑膜组织和其他基质。其处理方法与肾结核相同。

穿刺后立即对3％柠檬酸钠溶液（比例为1：1）中的滑液进行微生物学检查，以防止凝结。

淋巴结结核。淋巴结穿刺抽取的脓液的检查方法与脓肿脓液的检查方法相同。手术干预和活检过程中获取的淋巴结组织的检查方法与其他类型结核病的检查方法相同。

由于几乎没有阳性结果，因此很少对粪便中的结核分枝杆菌进行研究。

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分枝杆菌显微镜检查

痰液显微镜检查是一种相对快速、简单且经济的方法，所有疑似结核病的病例都应进行。此外，痰液显微镜检查还可用于评估化疗效果，并在缺乏培养结果的情况下确认患者是否康复或治疗失败。

采用两种显微镜检查方法：

• 直接显微镜检查法，直接从诊断材料中制备涂片；
• 一种利用显微镜对用净化剂处理过的材料制备的沉积物进行分析的方法，用于文化研究。

第一种方法用于仅进行微观研究的实验室（综合医疗网络的临床诊断实验室）。

通过浓缩诊断材料（例如，通过离心）可以获得显微镜检查的最佳效果。

为了以50%的概率通过显微镜检查检测出结核分枝杆菌，1毫升痰液必须含有超过5000个微生物细胞。肺结核患者的痰液通常含有大量抗酸菌，这使得它们能够通过细菌镜检可靠地检测出来。通过检查同一患者的多个痰液样本可以提高该方法的诊断灵敏度。阴性的细菌镜检结果并不能排除结核病的诊断，因为有些患者的痰液中所含的分枝杆菌数量少于显微镜检查所能检测到的数量。痰涂片准备不当也可能是导致细菌镜检结果阴性的原因。

检测涂片中抗酸分枝杆菌最常用的方法是齐尔-尼尔森染色法。该方法基于石炭酸品红透过包含蜡脂层的细胞膜渗透到微生物细胞中，同时加热并借助苯酚的强蚀刻作用。随后，用25%的硫酸溶液或3%的盐酸醇溶液对涂片进行脱色，使所有非抗酸结构脱色。脱色后的涂片部分用0.3%的亚甲蓝溶液染色。分枝杆菌无法识别常规的苯胺染料，因此抗酸分枝杆菌被染成覆盆子红色，而其他微生物和细胞成分则被染成蓝色。

检查根据齐尔-尼尔森染色法获得的涂片时，请使用光学双目显微镜，配备浸入式物镜（放大倍数为90倍或100倍）和目镜（放大倍数为7倍或10倍）。检查100个视野，足以检测出涂片中的单个分枝杆菌。如果检查结果为阴性，建议再检查200个视野进行确认。记录结果，以指示检测到的抗酸分枝杆菌（AFB）的数量。

除了这种方法外，荧光染料染色也用于发光显微镜，从而获得最佳结果。使用这种方法可将显微镜的效率提高10-15％。当用发光染料（金胺、罗丹明等）处理分枝杆菌时，这些物质也会与微生物细胞的蜡状结构结合。当染色的细胞受到激发光源（特定光谱的紫外线）照射时，它们会在黑色或深绿色背景下发出橙色或亮红色的光。由于可见图像的高亮度和对比度，显微镜的整体放大倍数可降低4-10倍，从而扩大视野并缩短样品的观察时间。此外，由于景深显著增加，研究的舒适度也得以提高。

使用荧光显微镜观察涂片的同一区域所需的时间比使用光学显微镜观察根据齐尔-尼尔森染色的涂片所需的时间要少得多。如果一位显微镜技术人员在一个工作日内观察大约20-25张这样的涂片，那么借助荧光显微镜，他可以同时检查60-80多个样本。经验丰富的显微镜技术人员知道，用金胺和罗丹明的混合物对细胞进行染色在某种程度上对抗酸分枝杆菌具有特异性，在这种情况下，它们呈现金黄色的杆状结构。腐生菌则被染成绿色。

荧光显微镜方法的另一个重要优点是能够检测出在多种不利因素（特别是强化化疗）的影响下失去耐酸性的变异分枝杆菌，因此无法通过 Ziehl-Neelsen 染色检测到。

荧光显微镜法的缺点包括显微镜及其操作成本相对较高。然而，在集中式实验室或其他大型实验室中，如果工作量超过三名实验室技术人员使用三台传统显微镜的常规工作量，则使用一台荧光显微镜会更经济。

细菌镜检方法特异性较高（89-100%）。任何显微镜检查方法获得的阳性结果中，约97%可与细菌培养结果明确证实。

需要注意的是，通过对病理材料涂片进行显微镜检查，无法确定所检测到的耐酸分枝杆菌的种类。显微镜检查只能得出标本中是否存在耐酸微生物的结论，这是因为自然界中存在大量形态学上与结核分枝杆菌相似的非结核性耐酸微生物。

显微镜结果的评估以半定量单位进行。

为了能够比较不同显微镜检查方法的结果，引入了经验系数。例如，为了将荧光染料染色的涂片结果与光学显微镜研究（放大1000倍）的数据进行比较，需要将荧光显微镜检测到的抗酸分枝杆菌数量除以相应的系数：在显微镜放大250倍时，除以10；在放大450倍时，除以4；在放大630倍时，除以2。

肺外结核的显微镜检查特点

可进行直接显微镜检查，也可对增菌后制备的涂片进行显微镜检查，随后根据齐尔-尼尔森法或荧光染料进行染色。由于材料中分枝杆菌浓度低，直接显微镜检查涂片效果不佳，因此使用增菌方法更为合理。离心法最为有效。如果生物材料粘稠，则可使用离心法同时进行均质和液化，该过程使用离心力为 3000 g 的高速离心机和次氯酸盐溶液进行。其他增菌方法，例如微浮选法，由于会形成具有生物危害性的气溶胶，目前尚未使用。

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结核病的培养诊断方法

接种法（或称培养法）比涂片镜检法灵敏度更高，且具有诸多优势。它能够在被检样本中检测到数十个活体分枝杆菌，具有很高的诊断价值。这对于检测来自新诊断或已治疗且排出少量分枝杆菌的患者样本尤为重要。

与显微镜检查相比，细菌培养研究可将结核病患者的检出率提高15-25%以上，并可在结核病早期（此时结核病尚易于治疗）确诊。细菌培养研究的一个非常重要的优势在于，它能够获得病原体培养物，并对其进行鉴定和研究，以评估其药物敏感性、毒力和其他生物学特性。

培养方法的缺点包括其持续时间（材料等待期长达10周）、成本较高以及处理诊断材料的复杂性。

诊断材料播前处理的原则

传统的微生物学方法无法用于结核病检测。这是因为结核分枝杆菌生长非常缓慢，而大多数临床样本中含有快速生长的化脓性、腐败性微生物和真菌。它们在营养丰富的培养基中快速生长，会干扰分枝杆菌的发育，导致无法分离出结核病病原体，因此诊断材料在播种前必须进行预处理。此外，从患者呼吸道释放的分枝杆菌通常被大量黏液包围，使其难以浓缩。因此，在播种痰液和其他类似材料之前，必须对其进行液化和消毒处理。

所有清洁剂和去污剂都会对分枝杆菌产生或多或少的毒性作用。处理后，高达90%的分枝杆菌可能会死亡。为了保留足够数量的分枝杆菌，必须采用温和的处理方法，一方面抑制快速生长的化脓性和腐败性微生物，另一方面最大限度地保留材料中分枝杆菌的活力。

根据材料、其均匀性和污染程度，使用不同的去污剂进行预接种处理：对于痰液 - 4％氢氧化钠溶液，10％磷酸三钠溶液，苯扎氯铵磷酸三钠，NALC-NaOH（N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠），最终NaOH浓度为1％，对于尿液和其他液体材料 - 3％硫酸溶液，对于受污染的样品，含脂肪的材料 - 浓度高达5％的草酸溶液。此外，在某些情况下，会使用酶和表面活性剂（洗涤剂）。使用Tween和一些其他洗涤剂会伴随较少的分枝杆菌细胞死亡（40-50％存活）。但是，它们只能用于液体材料。试剂盒中生产的NALC-NaOH是世界上使用最广泛的。该方法可以分离超过85％的分枝杆菌细胞群。含组织的固体材料的去污更加困难，因为难以判断均质过程中材料的分散程度。例如，处理淋巴结活检样本时，外来菌群污染的频率通常会增加。在这种情况下，可以使用1%的依托溴铵。

非均质材料在加入去污剂的情况下，使用玻璃珠进行均质处理。液体材料预先离心，仅处理沉淀物。

播种孵化技术

初步处理后，将材料离心，使分枝杆菌沉淀，并增加其在沉积物中的含量（“沉积物富集”）。将所得沉积物中和，然后接种到高浓度营养培养基或含有液体（半液体）培养基的试管表面。用剩余的沉积物制备用于显微镜检查的涂片。接种技术必须防止诊断材料的交叉污染。

为了对微生物学研究结果进行可靠的临床解释，必须遵守以下规则：必须对同一诊断材料样本同时进行显微镜研究和培养研究。

将接种好的试管水平放置于37 ^℃恒温箱中培养2天。这可确保培养基更均匀地吸收接种材料。2天后，将试管垂直放置，并用橡胶或硅胶塞密封，以防止接种培养基干燥。

将作物置于37 ^° C恒温箱中保存10-12周，并每周定期检查。每次控制检查均记录以下参数：

• 从播种之日起可目视观察到的生长期；
• 生长率（CFU 数量）；
• 培养物被外来微生物菌群或真菌污染（此类试管被移除）；
• 没有可见的生长。试管留在恒温器中，直到下次检查。

营养培养基

用于培养分枝杆菌的培养基种类繁多：固体、半液体和液体。然而，目前已知的培养基均无法确保所有分枝杆菌细胞的生长。因此，为了提高效率，建议同时使用2-3种不同成分的培养基。

世界卫生组织 (WHO) 推荐使用 Lowenstein-Jensen 培养基作为结核病原体初步分离和药物敏感性测定的标准培养基。这是一种致密的鸡蛋培养基，接种细菌镜检阳性材料后 20-25 天即可获得分枝杆菌的生长。接种细菌镜检阴性材料则需要更长的培养期（最长可达 10-12 周）。

在我国，ER Finn 提出的 Finn-II 蛋类培养基已得到广泛应用。该培养基的不同之处在于，它使用谷氨酸钠代替 L-天冬酰胺，从而激活分枝杆菌中其他氨基酸合成途径。该培养基中分枝杆菌的生长出现得较早，分离率比 Lowenstein-Jensen 培养基高 6-8%。

为了提高肺外结核病的细菌学诊断效率，建议在营养培养基中加入改良的Finn-II培养基。为了促进细菌生长，在Finn-II培养基中额外添加0.05%的巯基乙酸钠，以降低氧浓度。为了保护分枝杆菌的酶系统免受脂质过氧化毒性产物的侵害，在Finn-II培养基中添加浓度为0.001 μg/ml的抗氧化剂α-生育酚乙酸酯。诊断材料接种采用标准方法。

在俄罗斯的抗结核病实验室中，还使用其他改良的高浓度培养基：GG Mordovsky 提出的“Novaya”培养基、VA Anikin 开发的 A-6 和 A-9 培养基等。

由于化疗过程中，微生物细胞的各项代谢系统受到损害，部分分枝杆菌群失去了在常规培养基中正常生长发育的能力，需要渗透平衡（半液体或液体）培养基。

诊断材料培养结果的评估和记录

一些分枝杆菌菌株和类型生长缓慢，甚至可能在第90天才开始生长。此类培养物的数量很少，但这迫使播种苗必须在恒温箱中保存2.5-3个月。

结核分枝杆菌的毒性培养物通常在固体鸡蛋培养基中生长，形成大小和外观各异的R型菌落。菌落干燥、起皱，呈象牙色，略带色素。在其他培养基中，结核分枝杆菌菌落可能更湿润。化疗后或治疗期间，可能会分离出光滑、湿润生长的菌落（S型）。

在分离培养物时，使用一组特殊研究来区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌和抗酸腐生菌。

阳性结果需对生长的菌落涂片进行强制性显微镜检查，涂片需根据齐尔-尼尔森染色法进行。分枝杆菌生长情况为：涂片上可见鲜红色的杆状菌丝，单株或成群，簇生成毡状或辫状。在幼菌培养物中，尤其是从长期接受化疗的患者体内分离的菌丝，其分枝杆菌具有明显的多态性，甚至可出现类似真菌菌丝体的短小、近球状或细长的变体，以及杆状菌丝。

分枝杆菌的生长强度按以下方式表示：(+) - 试管中 1-20 CFU（细菌排出量低）；(++) - 试管中 20-100 CFU（细菌排出量中等）；(+++) - 试管中 >100 CFU（细菌排出量丰富）。在结核病的实验室诊断中，仅仅通过某种方法检测出分枝杆菌是不够的，还需要详细了解分枝杆菌的数量和性质、其组成和特性。这些数据可以帮助人们正确解读病情，制定治疗策略并及时调整治疗方案。

近年来，人们提出了使用添加各种生长添加剂的琼脂培养基和特殊混合气体来加速分枝杆菌的生长。为了促进分枝杆菌在这些培养基中的生长，需要在培养过程中创造二氧化碳含量较高（4-7%）的气体环境。为此，人们使用专门的二氧化碳培养箱_。然而，自动化分枝杆菌培养系统发展最为迅速：MGIT-BACTEC-960 和 MB/Bact。

其中一个系统是MGIT（分枝杆菌生长指示管）系统，它是一项高科技研发成果，旨在加速结核病的细菌学诊断，并确定分枝杆菌对一线药物和部分二线药物的敏感性。MGIT设计用于VASTEC-960设备。微生物在专用试管中培养，使用基于改良的Middlebrook-7H9培养基的液体培养基。为了刺激分枝杆菌的生长并抑制外来菌群的生长，我们使用MGIT生长补充剂和PANTA抗菌药物混合物。

微生物生长通过光学记录。该方法基于荧光，当分枝杆菌在生长过程中消耗氧气时，荧光就会产生。一种依赖氧气的荧光染料被封装在一个特殊的试管底部，并被一层硅胶覆盖。分枝杆菌的繁殖会导致试管中氧气含量减少，氧气浓度降低，从而导致荧光增强。当试管受到紫外线照射时，荧光就会变得可见，并被VASTES-960设备内置的光传感器自动记录。发光强度以生长单位（GU）为单位。生长数据会自动输入计算机并保存。通过计算机分析生长曲线，可以了解不同分枝杆菌群（包括非结核分枝杆菌群）的存在情况，并有助于评估分枝杆菌的生长特性。

引入此类系统后，结核分枝杆菌的生长时间显著缩短，在VASTEC-960上平均生长11天，在MB/Bact上平均生长19天，而在标准高密度营养培养基上则为33天。需要注意的是，这些系统需要高素质的人员。在液体培养基上播种材料时，必须同时在Lowenstein-Jensen培养基上播种，当结核分枝杆菌在其他培养基上无法生长时，Lowenstein-Jensen培养基可作为备用培养基。

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分枝杆菌药物敏感性测定

确定结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药谱和敏感性具有重要的临床意义，并且对于耐药结核病传播的流行病学评估也具有重要意义。此外，监测耐药性可以评估整个抗结核计划的有效性，是衡量所有抗结核措施有效性的重要指标。

药物敏感性测试的频率和时间：

• 治疗开始前，一旦确定治疗策略和战术：
• 当从患者的各种材料（痰液、BAL、尿液、渗出液、脑脊液等）中分离培养物时，所有分离的菌株都应进行检查：
• 在没有临床和放射学动力学的情况下，强化治疗阶段结束时：
• 如果发生以下情况需要改变治疗方案：
  • 痰液检查无阴性；
  • 痰液培养阴性后重新进行培养；
  • 涂片中抗酸杆菌（AFB）含量在最初下降后急剧增加。众所周知，从结核病患者的标本中分离出对药物敏感性不同的结核分枝杆菌菌株。不同菌株对抗结核药物的敏感性可能因药物谱、耐药程度、频率和耐药发展速度而异。

结核分枝杆菌的耐药程度是按照既定的标准来确定的，该标准侧重于耐药的临床意义，取决于药物的抗结核活性、药代动力学、病变中的浓度、最大治疗剂量等。

目前分枝杆菌的药物敏感性测定主要采用微生物学方法：

• 绝对浓度（固体或液体营养培养基稀释法），
• 比例，
• 阻力系数。

通常，耐药性表现为肉眼可见的结核分枝杆菌菌落生长，然而，也有一些方法可以在分枝杆菌细胞分裂的早期阶段以显色反应的形式诱导其生长。这些方法将检测时间从3-4周缩短至2周。

世界卫生组织化疗委员会推荐的绝对浓度法已在俄罗斯推广，并成为一种统一的方法。从方法学角度来看，该方法最为简单，但对实验室操作的标准化和精确度要求较高。药物敏感性试验需要一组装有抗结核药物改良培养基的试管。该试管包含2-3个试管，每个试管含有不同浓度的每种药物，一个对照试管，培养基中不含该药物，以及一个含有1000 μg/ml水杨酸钠或500 μg/ml对硝基苯甲酸的试管，用于检测非结核分枝杆菌的生长情况。

要配制一套含制剂的培养基，请使用改良的Lowenstein-Jensen培养基（不含淀粉），将其倒入烧瓶中。在每个烧瓶中加入一定体积的相应稀释度的抗结核药物。将烧瓶中的内容物充分混合，倒入试管中，在85°C的温度下以倾斜位置凝固40分钟。建议使用带自动控温的电动凝固仪凝固培养基。含抗结核药物的培养基

第一排可在2-4°C冰箱中保存1个月，第二排药物则最多可保存2周。含有药物的培养基不宜在室温下保存。制备抗结核药物溶液时，需考虑其活性，计算浓度时需考虑药物非特异性部分的分子量、纯度等因素。为测定药物敏感性，仅使用化学纯物质。

该方法的原理是确定能够抑制相当一部分分枝杆菌生长的抗结核药物的浓度。如果操作正确，该方法具有良好的可靠性。

进行测试之前，必须确保分离的结核分枝杆菌培养物不含有外来微生物群落。在0.9％氯化钠溶液中，从分枝杆菌培养物制备每毫升含有5亿个微生物体的均匀悬液（光学浊度标准5个单位）。用0.9％氯化钠溶液（1:10）稀释所得悬液，并将0.2毫升悬液加入到培养基组的每个试管中。将接种的试管放入37°C的恒温箱中，水平放置2-3天，使培养基的倾斜表面均匀地接种结核分枝杆菌悬液。然后将试管移至垂直位置，培养3-4周。3-4周后记录结果。

由于从临床材料中分离病原体在营养培养基上至少需要1-1.5个月的时间，因此使用该方法进行药物敏感性测定的结果最早也要到接种材料后2-2.5个月才能获得。这是该方法的主要缺点之一。

分枝杆菌药物敏感性试验结果的解读基于一定的标准。在固体培养基中，如果在含有药物的试管中生长的分枝杆菌菌落数量不超过20个，而在不含药物的对照试管中生长旺盛，则认为该培养物对培养基中所含药物浓度敏感。只有当菌落数量超过20个时，才认为该培养物对特定浓度具有耐药性。在实践中，如果在试管中获得接近20 CFU的生长结果，则必须告知临床部门，这种情况下药物的敏感性或耐药性处于临界状态，因为这有时可以解释临床指标不明确的动态变化。

对于各种制剂，都会设定一个特定的浓度，在该浓度下可以观察到临界比例的分枝杆菌种群繁殖。该浓度被称为“临界浓度”。在含有临界浓度制剂的营养培养基中，分枝杆菌种群的生长量可作为稳定性的标准。

在国内结核病学实践中，确定耐药性时并不局限于确定临界浓度。这是因为，扩大病原体耐药性水平的定义，使临床医生能够更准确地制定化疗策略，利用对药物组合增效作用的了解，预测交叉耐药性，或使用更有效的抗结核药物。

绝对浓度法最简单，但也最容易在实施过程中出现误差。比例法更可靠，尤其是在测定二线药物敏感性时，并且在俄罗斯以外地区应用更广泛。它考虑到了绝对浓度法的缺点，但实施起来更费力。

该方法与绝对浓度法非常相似。药物试管的制备与绝对浓度法相同。然而，结核分枝杆菌悬液的种子剂量减少了10倍，从而消除了某些结核分枝杆菌菌株对乙胺丁醇、丙硫异烟胺、卷曲霉素等药物自发产生耐药性的概率。作为对照，使用2或3个试管，其种子剂量等于试管中的剂量，依次稀释10倍和100倍。耐药性标准是肉眼观察到的结核分枝杆菌生长比例。对于一线药物，耐药性标准是初始菌落超量生长1%；对于二线药物，耐药性标准是初始菌落超量生长1%或10%以上，具体取决于所选的临界浓度。

1997年，世界卫生组织和国际防结核病联盟抗结核药物耐药性检测工作组对这些标准进行了调整，建议将在下列浓度的致密Lowenstein-Jensen蛋类培养基中生长的分枝杆菌视为具有耐药性：

• 双氢链霉素-4μg/ml；
• 异烟肼 - 0.2 µg/ml：
• 利福平 - 40 微克/毫升：
• 乙胺丁醇——2 微克/毫升。

2001年，针对以下二线药物提出了临界浓度（临界比例为1％）：

• 卷曲霉素——40微克/毫升；
• 丙硫异烟胺——40微克/毫升；
• 卡那霉素-30μg/ml；
• 紫霉素-30μg/ml；
• 环丝氨酸-40微克/毫升；
• 氨基水杨酸-0.5微克/毫升；
• 氧氟沙星——2 mcg/ml。

生长结果在培养 4 周后进行初步评估，在培养 6 周后进行最终评估。

吡嗪酰胺在现代结核病化疗中被广泛使用，其药敏试验建议的临界浓度为200 μg/ml。然而，目前尚无普遍接受的在固体培养基中测定该药物耐药性的方法，因为其抗菌活性仅在酸性环境（pH <6）下才有效，而这在技术上难以维持。此外，许多临床结核分枝杆菌培养物难以在酸性环境的鸡蛋培养基中生长。

为了评估分枝杆菌药物敏感性测定结果的质量，建议通过平行测定标准菌株 H37Rv 的敏感性来控制每一批新的 Lowenstein-Jensen 培养基。此外，为了确保方法获得良好的可重复性和正确的结果，必须满足某些微生物学标准。这些标准包括结核分枝杆菌培养物的活力、获得均匀悬浮液和悬浮液的规则、结核分枝杆菌培养物的筛选规则以及所选菌群的代表性。如果细菌排泄量极差，则确定耐药性的可靠性会降低。

最近，使用自动化系统测定药物敏感性的方法被认为很有前景。该领域最先进的是基于 VASTEC MGIT-960 的开发。在这种情况下，结核分枝杆菌的药物敏感性是根据改进的比例法确定的。在测定过程中，将对照管和含药管中结核分枝杆菌的生长率进行比较。为了确定对链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇的敏感性，使用 SIRE 试剂盒中包含的增菌添加剂和抗生素。为了确定对吡嗪酰胺的敏感性，使用 PZA 试剂盒。在测试过程中，将结核分枝杆菌悬浮液接种到含药试管中，并将所有药物的悬浮液稀释 100 倍接种到对照管中，但吡嗪酰胺除外，其悬浮液稀释度为 10 倍。稳定性标准为：当对照管中的分枝杆菌生长量达到400 GU时，分枝杆菌生长指标达到100 GU（参见“分枝杆菌分离培养方法”）。结果将自动记录和解释，并由输入或选择的程序设置。

将装有液体培养基的试管中的最终浓度作为临界浓度。目前，一线药物和部分二线药物均已制定了临界浓度。需要注意的是，结核分枝杆菌对环丝氨酸和氨基水杨酸的敏感性测定仅在鸡蛋培养基中进行。

所述系统的具体操作方案允许对分离培养物（使用高浓度营养培养基）以及在MGIT试管中使用分枝杆菌的原代生长物进行药物敏感性测试。后者显著缩短了进行培养研究所需的时间，可在采集材料后3周内获得结核分枝杆菌培养的完整结果（包括药物敏感性信息），而传统方法通常需要3个月才能获得结果。当患者处于强化治疗阶段时，及时获得结果可以弥补相对较高的研究成本。

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分枝杆菌的分化

鉴于所用培养基并非严格选择性培养基，分离出的分枝杆菌必须进行后续鉴别。鉴别分枝杆菌的必要性源于该属代表所致病理过程的一些特点：结核病和分枝杆菌病的病程和预后不同，以及对某些抗结核药物存在天然耐药性。

人们认识到，结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的初步鉴别是根据以下特征进行的：在密集营养培养基上的生长速度、色素形成、菌落形态、耐酸性的存在和生长的最适温度。

遗憾的是，目前尚无单一的实验室方法能够可靠地区分结核分枝杆菌复合群与其他抗酸分枝杆菌；然而，将上述体征与下面给出的一系列生化测试结果相结合，可以高达 95% 的概率识别出结核分枝杆菌复合群。

为了区分结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、卡氏分枝杆菌等）与缓慢生长的非结核分枝杆菌，可使用基本生化测试来检测是否存在以下体征：

• 产生烟酸的能力（烟酸测试）：
• 硝酸还原酶活性；
• 耐热过氧化氢酶；
• 在含有水杨酸钠（1mg/ml）的培养基上生长。

作为附加测试，还可以使用含有 500 μg/ml 对硝基苯甲酸或 5% 氯化钠的培养基进行生长测试。

许多细菌实验室仅在复杂层面上识别这些微生物，这是由于实验室的能力有限以及专家的方法能力有限。

在实践中，大多数情况下，以下检测足以区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌：烟酸、硝酸还原酶、吡嗪酰胺酶，以及在含有2 μg/ml噻吩-2-羧酸酰肼的培养基中的生长记录。考虑到结核分枝杆菌复合群具有以下特征：

• 生长缓慢（超过3周）；
• 生长温度在35-37 ^℃之间；
• 没有色素沉着（象牙色）；
• 明显的抗酸着色；
• 烟酸试验阳性；
• 硝酸还原酶试验阳性；
• 缺乏耐热过氧化氢酶（68 ^o C）。
• 在含有以下成分的 Lowenstein-Jensen 培养基中无法生长：
  • 1000 µg/ml 水杨酸钠，
  • 500 mcg/ml对硝基苯甲酸，
  • 5%氯化钠：
• 在1-5 μg/ml噻吩-2-羧酸存在下生长。

随着结核病或分枝杆菌病相关HIV/AIDS病例登记频率的增加，分离分枝杆菌的鉴别诊断的重要性将显著提升。目前，尚无绝对把握确定区域实验室是否已准备好正确完成此类工作。

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结核病的免疫学诊断

许多普遍存在的现象、制剂和免疫学检测最初都是在结核病或分枝杆菌免疫反应模型中发现的。其中包括卡介苗和结核菌素，以及皮肤药敏试验（结核菌素试验 - 皮尔凯反应和曼图反应）等现象，以及致敏动物皮下注射结核菌素后的反应（科赫现象）。一些传染病的首批抗体也是在结核病中发现的。当然，对抗结核免疫机制及其遗传调控的理解越深入，免疫学方法和影响免疫的制剂在解决结核病学实际问题中的应用就越广泛。

目前最重要、最复杂的实际问题被认为是在人群大规模筛查过程中发现结核病。然而，尽管有大量关于“成功”的报道（基于有限的材料），但目前尚无适用于此目的的免疫学方法（可在“任何人”手中重复）或药物。

免疫学方法，特别是血清学研究（确定抗原、抗体）和结核菌素激发试验，在临床实践中得到广泛应用。

血清学方法可以确定身体不同环境中的抗原和抗体，是鉴别诊断中使用的免疫学研究中最重要的方法。

结核分枝杆菌抗体测定的特异性取决于免疫分析中使用的抗原。目前已提出了许多抗原，其中第一个是结核菌素PPD：

• 来自培养液的PPD和其他复合制剂；
• 超声波崩解剂；
• Triton 提取物和其他复杂的细胞壁制剂；
• 5-抗原（丹尼尔）；
• 60-抗原（Coccito）；
• 脂阿拉伯甘露聚糖；
• 脐带因子（海藻糖-6,6-二肌酸）；
• 酚类和其他糖脂；
• 脂多糖；
• 纤连蛋白结合抗原；
• 蛋白质（通常是重组的）；81、65、38、34、30、19、18、16、15.12 KDA 等。

经过俄罗斯和外国科学家多年的研究，确定了结核病抗体形成的主要模式和血清学诊断的有效性：抗原越复杂，检测的灵敏度越高，特异性越低。不同国家的特异性有所不同，这取决于人群中结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的感染情况、卡介苗接种情况等。儿童血清学诊断的信息量低于成人。对于原发性结核病（儿童更常见），IgM 检测信息量更大；对于继发性结核病，IgG 检测信息量更大。对于 HIV 感染者，血清学诊断在确定抗体方面的信息量降低。抗体测定的有效性取决于许多“临床因素”：病程的活跃性（有无“分离”分枝杆菌、是否存在腐烂空洞、浸润程度）、病程的普遍性、病程的持续时间。

酶联免疫吸附试验（EIA）的灵敏度约为70%。该研究的有效性不足是由于其特异性较低。此前，曾考虑在高危人群中进行血清学筛查，尤其是在肺部出现结核病后病变的人群中。

为了提高ELISA的特异性，人们正在寻找特异性更高的抗原，包括通过基因工程获得的抗原：ESAT-6等（见上文）。使用严格特异性抗原（38 kDa，ESAT）可以提高特异性，但会显著降低分析的灵敏度。除了ELISA（实验性实验室测试系统，例如Pathozyme ELISA试剂盒）外，还提供带有侧向过滤（Mycodot）的免疫层析试剂盒，以及其他类似的测试（膜点分析），并可直观评估测试结果。进行这些测试时，分析需要10-30分钟；它们不需要特殊设备，只需对结果进行直观评估，这具有一定的主观性。这些方法的灵敏度和特异性特征与传统ELISA大致相同（分别为70％和90-93％）。

在结核病鉴别诊断方法中，免疫分析方法作为一种补充方法，具有一定的价值，尤其是在诊断结核病肺外形式方面。ELISA法在脑脊液检查中诊断结核性脑膜炎最为有效。在这种情况下，该分析的敏感性为80-85%，特异性为97-98%。有资料显示，泪液中检测结核分枝杆菌抗体有助于诊断结核性葡萄膜炎。

体外诱导γ干扰素合成

干扰素γ（IFN-γ）是一种特异性免疫保护因子，通过激活巨噬细胞的酶系统实现。致敏T淋巴细胞与分枝杆菌抗原相互作用，诱导IFN-γ合成。

结核菌素PPD和通过基因工程获得的特定抗原均可用作抗原，特别是ESAT-6抗原（分子量为6 kDa的早期分泌抗原）和CFP-10（培养滤液蛋白，10 kDa）。卡介苗和其他分枝杆菌的细胞中不存在基因工程或重组抗原。使用结核菌素时，IFN-γ诱导试验的结果与结核菌素皮肤试验的结果相当（直接相关）。使用基因工程抗原时，测试结果更具特异性，并且不依赖于之前的BCG疫苗接种情况。对于未接触过结核病感染的接种过疫苗的个体，该测试的特异性为99％。在结核病患者中，该测试的敏感性为81％至89％。

目前已开发出一些检测和诊断方法，其原理是将血液中分离的全血细胞或单核细胞与结核分枝杆菌抗原在体外进行短期培养，然后测定干扰素-γ (IFN-γ) 浓度或计数合成干扰素-γ (IFN-γ) 的T淋巴细胞数量。使用与干扰素-γ (IFN-γ) 结合的单克隆抗体，通过 ELISA 法测定试管中合成的干扰素浓度。然后，使用标准干扰素-γ (IFN-γ) 进行校准，测定试管或板孔中的干扰素浓度。

在 Elispot 测试中，在涂有 IFN-γ 抗体的培养皿表面计数合成 IFN-γ 的 T 细胞数量。

美国食品药品监督管理局（FDA）批准的体外干扰素-γ诱导诊断试剂盒的研发者声称，该试剂盒无法区分潜伏性结核感染和活动性结核感染。因此，在结核感染率高的地区，该试剂盒没有直接的诊断价值。然而，在我国，该试剂盒可用于区分儿童结核感染和疫苗接种后过敏反应，以及评估治疗期间的特异性免疫水平。

目前国内正在研究体外测定特异性结核抗原诱导IFN-γ合成的检测体系。

结核病的免疫状态和病程、免疫矫正

在结核病治疗过程中，人体的抗原血症和免疫系统状态会发生变化。

关于渗出液和组织变化的数据大多相互矛盾。唯一可以充分证明的是，结核性肉芽肿通常含有大量活化的T淋巴细胞。

为了理解免疫机制在人类结核病治疗中的作用，有必要再讨论两点：

• 艾滋病患者产生多重耐药性的发生率特别高；
• 在存在多种药物耐药性的情况下（且没有感染 HIV），免疫紊乱（主要是 T 细胞免疫）尤为明显。

在结核病中，广泛使用各种免疫校正方法：首先，这些药物主要作用于T细胞免疫和单核吞噬细胞系统（胸腺激素，异烟肼，利可比林，多氧碘等），以及整个（减毒）分枝杆菌及其成分。

结核病的分子生物学诊断

传染病诊断中的分子生物学方法主要包括基于操作细菌和病毒病原体基因组材料的方法，以识别特定遗传物质——具有特定病原体物种或菌株特有核苷酸序列的DNA片段，用于分析决定病原体对某些药物敏感性的基因中的特定DNA序列，以及分析病原体某些基因的功能活性。自1985年卡丽·穆利斯（1989年诺贝尔奖获得者）发现聚合酶链式反应以来，分子生物学方法已在各种细菌和病毒感染的诊断和监测的科学研究和实际应用中得到广泛应用。

聚合酶链式反应方法的原理和能力

PCR技术能够在试管中几小时内将核苷酸序列（病原体DNA片段）扩增（倍增）数百万倍。该反应在单链DNA存在下进行，决定了其分析具有极高的灵敏度。

DNA链中某些片段的核苷酸序列决定了微生物遗传的独特性，这解释了PCR的高度特异性。

该方法对于检测和研究结核分枝杆菌特性的重要性在于，该微生物的生物学特性是生长非常缓慢的：结核分枝杆菌在培养过程中DNA的倍增时间为12至24小时。

PCR 方法的原理是扩增 - 在试管微体积中将特定 DNA 序列的片段进行多次、数百万次的扩增，并循环重复以下三个反应阶段，每个阶段都在不同的温度范围内进行：

• 第一阶段-双链 DNA 在加热时变性，其链发散；
• 第二阶段 - 引物（引发寡核苷酸）与选择用于扩增的严格特定的 DNA 片段链的末端部分互补结合（杂交）；
• 第三阶段——使用耐热 DNA 聚合酶完成 DNA 片段链。

为了进行扩增，试管必须包含基质DNA分子。四种脱氧核苷三磷酸（核苷酸），分别包含相应的含氮碱基：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）；人工合成的18-20个碱基对的引发寡核苷酸（引物）；一种耐热酶——DNA聚合酶（最适温度为68-72 ^° C），以及镁离子。

PCR的特异性取决于DNA片段的选择。根据片段的选择，合成侧翼引物寡核苷酸。杂交的特异性和DNA链的完成取决于以下含氮碱基对的互补性原理：腺嘌呤-胸腺嘧啶、鸟嘌呤-胞嘧啶。

为了确定结核复合体分枝杆菌的基因组，大多数检测系统中最有效的扩增靶标是IS6110 DNA片段，该片段在大多数结核分枝杆菌菌株的基因组中具有大量（10-20）的重复序列，这确保了分析的特异性和高灵敏度。同时，也描述了重复序列数量较少或缺失IS6110片段的结核分枝杆菌菌株。

从生物样本中提取 DNA 分子

为了进行 PCR，必须从生物材料中分离出最小体积的病原体 DNA 分子，并含有最少量的非特异性 DNA 和酶（DNA 聚合酶）的各种抑制剂。

样品制备必须在防止待研究样品与分离的DNA分子交叉污染的条件下进行。这需要用紫外线对房间进行预处理，并用含氯溶液对地板、桌子和设备的工作台面进行预处理。此外，还需要使用干净的手套、一次性试管和自动移液器吸头。

为了从不含大量白细胞、细胞碎片或盐分的临床样本（脑脊液、支气管灌洗液）中分离结核分枝杆菌的 DNA，只需以每分钟 3-4 千转的速度离心样本，向沉淀物中添加 20-30 µl 2% 的 Triton X-100 溶液，并在 90 ^o C 下加热 30 分钟即可。

痰液样本制备需要高效液化，通常使用4%氢氧化钠和N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)，每个样本用量为50-80毫克，具体取决于样本粘度。NALC溶液应临时配制，或将NALC粉末干粉直接加入样本中。液化后，将样本置于50毫升螺旋盖离心管中，以3,500-4,000 rpm (3,000 g)的转速离心15分钟，即与培养前痰液制备的推荐条件相同。

从沉积物中提取DNA，最常用的方法是基于使用5-6摩尔浓度的异硫氰酸胍溶液作为裂解剂，并使用吸附DNA分子的微孔氧化硅颗粒（“硅藻土”）。然后用2.5摩尔浓度的异硫氰酸胍溶液和乙醇溶液洗涤非特异性物质（包括可能的抑制剂），之后将DNA分子解吸到水中，并使用这些样品进行PCR。为了简化DNA提取技术，通常使用涂覆有氧化硅的磁性微粒代替“硅藻土”。在这种情况下，使用专门用于微管的磁力架来沉淀颗粒，而不是离心。

俄罗斯开发了一种独特的免疫磁分离结核分枝杆菌并提取病原体DNA的方法。该方法使用粒径为3-5μm、表面涂有氧化硅的磁珠，磁珠上通过化学键结合有结核分枝杆菌多克隆抗体（兔抗体）。痰液样本经碱性裂解后，用酸性Tris-HCl溶液中和，并与免疫磁珠吸附剂孵育。然后用可更换磁头的磁棒收集磁珠，转移至微管中沉淀。加入20-30μl 2% Triton X-100溶液，90℃加热30分钟。^上清液用作PCR分析的DNA基质。

从活检样本中提取结核分枝杆菌DNA是一个难题。活检裂解时，需要使用终浓度为200-500 mg/l的蛋白酶K，在56℃下过夜裂解^。然后，使用已知方法提取。在活检样本的PCR分析中，过量的非特异性DNA通常会导致反应抑制，需要重复提取DNA。

结果检测方法

反应完成后，利用各种方法识别病原体DNA的扩增片段。

凝胶电泳法是众所周知的。在这种情况下，获得的DNA片段可以通过含有所需特定DNA片段的阳性对照来识别，或者通过利用标准分子标记确定片段的大小（核苷酸对的数量）。

在双链 DNA 中的特定染料——溴化乙锭的存在下，合成的 DNA 片段在紫外线的影响下呈现为发光的带。

DNA 片段的大小是通过电泳根据从起点行进的距离确定的，必须与已知的分子量标记或阳性对照相对应。

确定 PCR 结果的其他方法基于单链 PCR 产物与互补寡核苷酸（用生物素标记的 DNA 探针）的杂交，然后使用酶促反应进行检测，例如，将链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物与生物素结合。

基于这种检测方式，人们发明了PCR分析仪，通过读取酶促反应发生后样品中的光密度，自动检测PCR结果。

这些方法的缺点包括实验室内部可能被较短的DNA分子片段污染。当这些分子进入新检测的样本时，它们会成为PCR的基质，导致假阳性结果。

为防止出现假阳性结果，对以下房间进行了严格的隔离规定：用于从生物样本中提取DNA的房间；用于检测结果（电泳）的房间；这些房间与洁净区隔离。这些房间代表着可能存在污染的区域。另一个隔离区域是洁净室，用于将待检测的DNA样本与PCR反应混合物一起放入试管中。最后，主要设备——DNA放大器——应被转移到一个单独的房间，可能是办公室。

为了防止先前反应产物（扩增子）的污染，一些 PCR 检测系统使用脱氧核苷尿苷代替脱氧核苷胸苷，后者在体外链合成过程中在相应位置构建，即天然 DNA 中的含氮碱基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。将尿嘧啶 DNA 糖基化酶添加到待分析材料的反应混合物中，只会破坏含有脱氧尿苷的污染片段，而不会破坏含有脱氧胸苷的天然待分析 DNA。随后在 94 ℃ 下加热^会使该酶失活，并且不会干扰 PCR 扩增。

有一种基于rRNA恒温扩增的检测系统，该系统首先进行DNA分子的逆转录和合成，DNA分子是随后合成RNA分子的基质。RNA扩增子在反应管溶液中杂交时，使用吖啶染色的DNA探针进行检测。该方法除了灵敏度高之外，还具有在同一管中进行分析的优势，从而避免了污染。据作者介绍，该方法在呼吸道样本中的灵敏度达到90%，特异性达到99%-100%。

实时PCR技术实现了新的检测方法。这些方法的主要区别在于，PCR反应及其结果检测在一个封闭的试管中同时进行。这不仅在技术上简化了分析方法，而且还避免了先前PCR产物对实验室场所和样品的污染。

在实时PCR中，检测结果通过荧光DNA探针与PCR扩增的特定DNA片段杂交产生的荧光来检测。荧光DNA探针的结构使得荧光标记物仅在与PCR扩增的目标DNA分子进行特异性杂交时，才会通过酶促反应释放或脱离荧光猝灭剂分子。随着与探针杂交的分子数量的增加，达到可检测水平的荧光强度与扩增产物的分子数量成正比。由于每个PCR循环中DNA片段分子的数量都会翻倍，因此检测到荧光并增加的循环次数与原始样本中的DNA分子数量成反比。如果将几种不同浓度的相应结核分枝杆菌DNA片段分子作为校准物引入反应中，则可以使用计算机程序计算出被研究材料中DNA基因组的数量。

每个标准样本均重复。定量标准是达到可检测荧光出现和发展所需的最少PCR循环数。横轴为循环数，纵轴为荧光值。DNA浓度与出现荧光所需的循环数成反比。右列（21-32）窗口显示相应浓度的循环数。10倍浓度的DNA片段（10 ² -10 ⁶ ml）之间的差异为3.2-3.4个循环。对于两名患者，IS6110片段的浓度约为10 ³ /ml和10 ⁴ /ml。考虑到结核分枝杆菌基因组中分析片段的重复次数（6-20），临床样本中的结核分枝杆菌数量分别约为100和1000个细胞。

PCR在结核病诊断中的应用

PCR方法在结核病快速诊断中的应用最为广泛，可用于检测临床样本中的结核分枝杆菌：痰液、支气管灌洗液、胸膜渗出液、尿液、脑脊液、骨溶解穿刺液、女性生殖道抽吸物以及各种活检样本。荷兰的一项研究收集了340例确诊为肺结核患者的约500份痰液和支气管灌洗液样本，比较了PCR、培养和涂片镜检方法的灵敏度。分析的灵敏度分别为92.6%、88.9%和52.4%。所有方法的特异性约为99%。

比较了涂片镜检、Lowenstein-Jensen培养基接种法、VASTES检测系统和PCR分析对结核分枝杆菌的检测效率。PCR的灵敏度为74.4%，镜检为33.8%，固体培养基接种法为48.9%，VASTES为55.8%。Lowenstein-Jensen培养基接种法的平均检测时间为24天，VASTES为13天，PCR为1天。

本文还讨论了使用 PCR 作为监测结核病治疗效果的灵敏、快速方法的潜力。

采用有效的化疗，通过PCR方法检测结核分枝杆菌DNA需要更长的时间才能确定——与荧光显微镜确定的细菌排泄物相比平均需要1.7个月，与细菌学检查相比平均需要2.5个月。

肺外结核的诊断

PCR 作为一种敏感方法的重要性对于肺外形式尤其重要，因为对于这些形式，临床和放射学方法以及传统的细菌学方法对于确定诊断材料中的结核分枝杆菌是无效的。

检测尿液样本时，17例活动性泌尿系统结核病患者中16例PCR分析结果为阳性，4例非活动性肾结核患者和39例泌尿系统非结核病患者PCR分析结果为阴性。

证实了PCR分析在疑似结核性发热患儿骨髓穿刺液研究中的有效性。为了诊断儿童结核性淋巴结炎，对67例疑似结核性淋巴结炎患儿的102份穿刺液和活检样本进行了研究。结果显示，实时PCR阳性率为71.6%，荧光显微镜检查阳性率为46.3%，培养检测阳性率为41.8%。对猫抓病患儿的50份淋巴结活检样本进行了研究，所有结果均为阴性。因此，证实了PCR分析的特异性为100%。在同一研究中，还证实了在淋巴结穿刺活检中检测出鸟分枝杆菌的可能性。

不孕症患者中女性生殖器结核的诊断是公认的最困难的诊断问题之一。在25例经腹腔镜检查疑似结核病的患者中，14例（56%）在子宫内膜活检、子宫内膜抽吸物和Douglas袋积液样本的PCR检测中获得了阳性结果。涂片显微镜检查和培养研究分别获得了1例和2例阳性结果。这些病例的PCR检测也呈阳性。大多数PCR阳性结果为组织学检查显示具有结核病特征的病例；少数为腹腔镜检查疑似结核病的病例。由于缺乏腹腔镜结核病数据，仅有1例获得了阳性PCR结果。

在诊断肺外结核病时，临床医生常常会质疑使用PCR方法检测血液样本能否鉴定出病原体。文献资料表明，在晚期HIV感染者中，血液样本中可能检测到结核分枝杆菌DNA。仅在移植肾和免疫抑制患者的各个器官广泛性结核病中检测到结核分枝杆菌DNA。

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分枝杆菌的种类鉴定

PCR 方法可非常有效地在获得原代生长物后快速鉴定结核分枝杆菌和某些类型的非结核分枝杆菌。在这种情况下，使用 PCR 可节省随后培养鉴定阳性结果所需的 7-10 天时间。PCR 研究在技术上非常简单，因为它不需要复杂的临床材料样本制备即可实现高灵敏度。在这种测试系统（Organon 的 MB BacT.）中检查 80 个阳性培养物时，所有阳性 PCR 分析结果都具有严格的特异性，并在 1 天内完成。为了在培养中获得其他类型的分枝杆菌进行鉴定，将病原体 DNA 与用吖啶标记的特定 DNA 探针杂交，然后使用化学发光计通过化学发光的外观检测菌株，或在杂交后通过目测在硝酸纤维素试纸上检测菌株。该试剂盒可识别有限数量的菌种：结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌和戈登分枝杆菌。

A. Telenti 等人还开发了一种相对简单且廉价的临床重要分枝杆菌种属识别方法，该方法基于 PCR 和随后用两种限制性酶（能够在特定位点切割 DNA 分子的酶）处理。在这种情况下，扩增编码热休克蛋白（65 kDa）的 DNA 片段，然后用两种酶（Bste II 和 Нае III）分别处理 PCR 获得的 439 个核苷酸对大小的 DNA 片段。然后，使用琼脂糖凝胶电泳分析获得的两种产物，使用一组长度为 100 至 1000 个核苷酸对的标准 DNA 片段（分子 DNA 标记）确定它们的大小（核苷酸对的数量）。在每种定义的物种（结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌）中，每种限制性酶都会发现 2 或 3 种不同大小的 DNA 片段。由此产生的不同大小的 DNA 片段的组合使得这些物种能够彼此区分。

目前正在开发一种生物 DNA 微阵列技术，该技术将有助于在一次研究中识别 100 多种分枝杆菌。

还可以通过 PCR 扩增 16S rRNA 的可变区，然后对扩增子进行测序并与相应的一级结构进行比较，来进行物种鉴定，这可以鉴定 40 多种分枝杆菌。

PCR 还可用于鉴定结核分枝杆菌复合体中的菌种，包括区分牛分枝杆菌和牛分枝杆菌 BCG。这是通过分析基因组区域 RD1、RD9 和 RD10 中某些基因的存在与否来实现的。RD1 在牛分枝杆菌 BCG 中不存在，但在包括牛分枝杆菌在内的强毒菌种中存在。

PCR检测结核分枝杆菌的药物敏感性

确定结核分枝杆菌药物敏感性或耐药性的分子遗传学方法，其任务简化为识别已知基因某些核苷酸序列中的突变。主要方法要么基于扩增后直接读取（测序）这些序列，要么基于PCR扩增的生物素标记DNA片段与DNA探针的杂交。这两种方法都涉及识别核苷酸序列中的替换，这些替换在使用DNA探针时会导致在硝酸纤维素膜上使用酶偶联物（链霉亲和素-碱性磷酸酶）进行杂交时杂交缺失或不完全——即LIPA-Rif-TB方法。

微生物芯片法是一种在与药物敏感性或耐药性的 PCR 扩增基因区域中的已知突变互补的微区域上局部固定的 DNA 探针上测量荧光的方法。进行此项研究的基本算法如下。从临床样本或分枝杆菌培养物中分离 DNA 后，必须进行 PCR 以扩增负责对利福平药物敏感性的 groB 基因的相应片段，或编码负责对异烟肼敏感性的分枝杆菌蛋白的 katG 和 inhA 基因的相应片段。使用琼脂糖凝胶电泳评估 PCR 结果，以确认收到了所需长度的相应 DNA 片段。然后，进行第二轮 PCR，将荧光标记引入 DNA。再次通过凝胶电泳确认 PCR 结果。随后，进行杂交（孵育过夜），并将所得材料在生物芯片上进行清洗。生物芯片是固定在小玻璃板上的大量短DNA链（探针），这些短DNA链与药物敏感型结核分枝杆菌可能发生突变的核苷酸序列以及导致耐药性的突变序列互补。DNA探针在玻璃板上的位置经过严格限定，并根据杂交过程中观察到的荧光水平，使用专用读取装置确定结果。最后，使用专用计算机程序确定分析结果。

近年来，基于实时PCR技术已经开发出确定结核分枝杆菌药物敏感性的替代方法，使得这些研究可以在密闭试管模式下进行。

图13-13为实时PCR检测结核分枝杆菌临床培养物对利福平耐药性的结果：218-对照样品（对利福平敏感）；93-Ser-Trp TCG-TGG突变阳性对照；4482-Ser-Leu TCG-TTG突变阳性对照；162-322-实验样品。4个通道扩增动力学曲线计算结果：通道1：393-Ser-Trp TCG-TGG突变阳性对照；通道2：4482-Ser-Leu TCG-TTG突变阳性对照；162、163、172、295-实验样品；通道4：所有参与实验样品的扩增动力学曲线。扩增反应阳性对照。结论：分析显示，在样本162、163、172、295中，存在决定利福平耐药性的突变：Ser-Leu TCG-TTG。katG和inhA基因也采用了相同的原理，决定了异烟肼的耐药性，这两个基因是最常见的突变。

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结核分枝杆菌菌株鉴定

结核分枝杆菌菌株鉴定研究最多的方法是限制性片段长度多态性 (RFLP) 技术，该方法基于酶 Pvu II 对结核分枝杆菌 DNA 进行片段化 (限制性片段化)，然后将获得的片段与其重复元件 IS6110 的 DNA 上的某些特定序列杂交。由于 IS6110 重复次数和在 DNA 上的位置不同，以及限制性酶的某些攻击点 (限制性位点) 与 IS6110 元件之间的距离不同，因此实现了种内变异。该技术非常复杂且劳动密集型。用限制性酶处理从结核分枝杆菌培养物中分离的 DNA 后，进行凝胶电泳，然后将不同长度的 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上，与 IS6110 元件的片段杂交，并使用酶促反应检测结果。由此产生的特异性条带模式表征了特定结核分枝杆菌菌株的DNA。计算机分析可揭示菌株的身份或亲缘关系。尽管RFLP方法最具鉴别力，即它能揭示出被分析菌株中最多的差异，但在某些菌株中观察到的IS6110重复次数较少（少于5次）时，该方法无效。图13-14显示了菌株的RFLP分型结果。

另一种选择是单链寡核苷酸分型（spoligotyping）方法——分析DR区正向重复序列之间的间隔DNA序列的多态性。在对菌株进行单链寡核苷酸分型时，使用限制DR区的引物进行PCR，然后形成不同长度的片段，这些片段与可变的中间DNA区杂交。研究人员认为，DR区间隔序列的分析似乎更简单、更高效，适用于菌株的初步筛查和初步流行病学分析，以及直接用于临床材料的研究。

显然，一种更有效且技术上更易于获取的方法是可变重复序列（VNTR，英文缩写）技术，即测定结核分枝杆菌DNA中可变数量的精确串联重复序列的方法。该方法仅基于PCR技术，无需额外操作。由于不同菌株和不同基因座的串联重复序列数量不同，因此在PCR产物的电泳图上可以测定和分析不同大小的片段。据研究人员称，与限制性片段长度多态性（RFLP）方法相比，VNTR技术能够更好地区分菌株。

近年来，人们对W-北京株结核分枝杆菌菌株（有时称为北京株）的传播给予了极大关注，该菌株具有很强的耐药性。

分子生物学研究质量的基本要求

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进行PCR的主要监管文件

俄罗斯联邦卫生部令：2000年2月7日第45号；2003年3月21日第109号；2000年2月21日第64号。指导原则：1.3.1888-04“感染III-IV致病群致病性生物因子材料PCR研究期间的工作组织”；1.3.1794-03“感染I-II致病群微生物材料PCR研究期间的工作组织”。2003年；3.5.5.1034-01“使用PCR方法时，对感染I-IV致病群细菌的测试材料进行消毒”，2001年。《结核病检测、诊断和治疗中微生物研究统一方法指南》附录11。

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职员

分子生物学研究可以由临床实验室诊断医生、细菌学家、病毒学家、临床诊断实验室生物学家以及具有中等医学教育并按照既定方式接受过专业化和高级培训的专家进行。

实验室场地布置

需要以下实验室设施：

• 样品处理区 - 按照方法指南 13.1888-04，适合处理致病性 III-IV 组传染性病原体的实验室。
• 制备 PCR 反应混合物的区域是一个实验室房间，可防止实验室内部污染 - “清洁”区域。
• • 如果使用电泳或杂交技术分析PCR产物，则根据PCR实验室的要求（方法指南1.3.1794-03，方法指南1.3.1888-04），从扩增管中提取扩增DNA片段并因此进入环境的实验室房间必须与前文所述的房间完全隔离。任何人员、设备、材料和物体从电泳区到样品处理区和“清洁”区的移动，以及通过通风系统或气流产生的空气流动，都必须完全隔离。PCR产物的荧光检测无需此区域。
• 记录和结果处理室配备了计算机和必要的办公设备。该房间可能配备无需打开试管即可检测PCR产物的设备，例如荧光PCR检测仪和用于实时PCR的热循环仪。

痰液初级处理的卫生和流行病学要求与处理结核分枝杆菌的标准微生物学要求相似。

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PCR诊断全套实验室设备

实验室套件包括以下房间的设备。

• 样品制备室，包含以下设备：防护等级 II“SP-1.2”的层流罩：用于 Eppendorf 试管的带加热盖的固态恒温器；13,000 rpm 的微量离心机；离心机（“Vortex”）；温度范围为 -20 ^° C 至 +10 ^° C 的冰箱；“Proline”系列可变容量移液器；带有捕获瓶 OM-1 的泵；移液器架；工作站架 200x0.5 ml；工作站架 50x1.5 ml；用于存放 80x1.5 ml 试管的架子；
• 反应混合物制备室：保护室 PCR 盒（“Laminar-C. 110 cm”）；离心机“Vortex”；“Proline”系列可变容量移液器；移液器架；工作站架 200x0.2 ml；用于存放试管的架子 80x1.5 ml；温度范围为 -20 ^° C 至 +10 ^° C 的冰箱；
• 电泳室：卧式电泳室；电源；透照仪；
• DNA扩增仪或核酸分析仪（实时PCR仪），配有电脑及软件；可放置在任何可用的房间内。如果使用实时PCR技术，则无需电泳室。

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外部质量控制

为了确保获得客观可靠的结果，实验室必须参与实验室研究质量的外部评估体系。

质量控制系统的参与者将收到：12 个装有细菌细胞冻干悬浮液的安瓿，其中两个含有大肠杆菌，3 个装有结核分枝杆菌（无毒菌株）的安瓿，浓度为 10 ² /ml；3 个装有相似菌株细胞的安瓿，浓度为 10 ⁴ /ml；2 个装有非结核分枝杆菌鸟型胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌的安瓿，浓度为 10 ⁵ /ml。

送去进行外部质量评估的测试已在两个在该领域拥有丰富经验的独立实验室进行了预测试。

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