造血干细胞

造血干细胞 (HSC) 与间充质祖细胞一样，具有多能性，可产生细胞系，其最终元素形成血液的有形成分，以及许多免疫系统的特化组织细胞。

所有血细胞都存在一个共同前体的假说，以及“干细胞”一词本身，都是 A. Maksimov (1909) 提出的。造血干细胞具有巨大的细胞团形成潜力——骨髓干细胞每天可产生 10 个细胞，这些细胞构成外周血的有形成分。1961 年，在恢复小鼠造血功能的实验中，证实了造血干细胞的存在。这些小鼠接受了致命剂量的放射性辐射，骨髓干细胞被破坏。将同基因骨髓细胞移植到这些接受致命辐射的动物体内后，在受体的脾脏中发现了离散的造血灶，这些灶来自单个克隆形成前体细胞。

随后，造血干细胞的自我维持能力得到了证实，并在个体发育过程中发挥造血功能。在胚胎发育过程中，造血干细胞（HSC）具有高迁移活性，这对于其迁移至造血器官形成区域至关重要。造血干细胞的这一特性在个体发育过程中也得以保留——由于其持续迁移，免疫活性细胞库得以持续更新。造血干细胞的迁移、穿透组织屏障、植入组织和克隆性生长能力，为多种造血系统病变相关疾病的骨髓细胞移植奠定了基础。

与所有干细胞资源一样，造血干细胞在其微环境（骨髓）中数量极少，这给其分离带来了一定的困难。从免疫表型上看，人类造血干细胞 (HSC) 的特征是 CD34+NK 细胞，能够迁移到血液中，并在免疫系统器官中定植或重新植入骨髓基质。需要明确的是，造血干细胞并非骨髓中最不成熟的细胞，而是源自前体细胞，其中包括休眠的成纤维细胞样 CD34 阴性细胞。已证实，具有 CD34 表型的细胞能够进入一般血液，并在其中将其表型转变为 CD34+，但在微环境的影响下，它们反向迁移到骨髓后，又会变成 CD34 阴性干细胞。在静息状态下，CD34-细胞不会对基质的旁分泌调控信号（生长因子、细胞因子）作出反应。然而，在需要增强造血强度的情况下，具有CD34表型的干细胞会响应分化信号，形成造血祖细胞和间充质祖细胞。造血是通过造血干细胞（HSC）与骨髓基质细胞成分直接接触而发生的，这些细胞成分由巨噬细胞、网状内皮细胞、成骨细胞、基质成纤维细胞和细胞外基质组成的复杂网络构成。骨髓基质基础不仅仅是造血组织的基质或“骨架”，它通过生长因子、细胞因子和趋化因子的旁分泌调节信号对造血进行精细调控，并提供血细胞形成所必需的粘附相互作用。

因此，不断更新的造血系统建立在能够长期自我维持的多能（从造血角度而言）造血干细胞的基础之上。在定向分化过程中，造血干细胞（HSC）会经历原代分化，形成具有不同细胞形态和免疫表型特征的细胞克隆。原始祖细胞和定向祖细胞的逐步形成最终导致形态学上可识别的各种造血系祖细胞的形成。造血过程错综复杂，包含多个阶段，其后续阶段的结果是细胞成熟，并释放成熟的形成细胞（红细胞、白细胞、淋巴细胞和血小板）进入外周血。

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造血干细胞的来源

造血干细胞被认为是研究最多的干细胞来源，这主要是因为它们在骨髓移植中的临床应用。乍一看，人们对这些细胞的了解相当多。在某种程度上，这是事实，因为造血干细胞的中期和成熟后代是最容易获得的细胞元素，其中每一种（红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和血小板）都已在各个层面上进行了仔细的研究——从光学显微镜到电子显微镜，从生化和免疫表型特征到 PCR 分析方法鉴定。然而，对造血干细胞的形态学、超微结构、生化、免疫表型、生物物理和基因组参数的监测尚未解决许多难题，而这些问题的解决对于细胞移植学的发展至关重要。造血干细胞在休眠状态下的稳定机制、其激活机制、进入对称或不对称分裂阶段的机制，以及最重要的是，致力于形成红细胞、白细胞、淋巴细胞和血小板等功能不同的血液形成元素的机制尚未确定。

骨髓中存在具有 CD34 表型的细胞，它们是间充质干细胞和造血干细胞的祖细胞，这提出了一个问题，即是否存在接近 CD34 阴性细胞的最早的向基质和造血谱系分化的细胞前体。通过长期培养的方法获得了所谓的长期培养起始细胞 (LTC-IC)。这种在骨髓基质基础上具有集落形成活性的前体细胞在一定的生长因子组合下的寿命超过 5 周，而培养中的定向集落形成单位 (CFU) 的活力仅为 3 周。目前，LTC-IC 被认为是 HSC 的功能类似物，因为具有很高的再增殖潜力，大约 20% 的 LTC-IC 具有 CD34+CD38- 表型，并表现出很强的自我更新能力。此类细胞在人类骨髓中存在，频率为1:50,000。然而，在长期（15周）培养条件下获得的髓系-淋巴系起始细胞应被认为是最接近造血干细胞（HSC）的细胞。这类细胞被称为LTC，存在于人脑骨髓细胞中，其频率比LTC-IC低10倍，并可形成髓系和淋巴系造血细胞系。

尽管用单克隆抗体标记造血干细胞并进行免疫表型鉴定是识别和选择性分选具有干细胞潜能的造血细胞的主要方法，但由此分离的造血干细胞（HSC）的临床应用却受到限制。在免疫阳性分选过程中，用抗体阻断CD34受体或其他标记抗原不可避免地会改变由此分离的细胞的性质。在磁柱上进行免疫阴性分离HSC被认为是更可取的。然而，在这种情况下，通常使用固定在金属载体上的单克隆抗体进行分选。此外，重要的是，这两种HSC分离方法都是基于表型而非功能特征。因此，许多研究人员倾向于使用HSC克隆形成参数分析，该分析可以通过集落的大小和组成来确定祖细胞的成熟度和分化方向。已知在定型过程中，集落中的细胞数量及其类型会减少。造血干细胞及其早期子细胞，称为“粒细胞-红细胞-单核细胞-巨核细胞集落形成单位”（CFU-GEMM），在培养中可形成大型多谱系集落，分别包含粒细胞、红细胞、单核细胞和巨核细胞。位于定型线下游的粒细胞-单核细胞集落形成单位 (CFU-GM) 形成粒细胞和巨噬细胞集落，而粒细胞集落形成单位 (CFU-G) 仅形成由成熟粒细胞组成的小型集落。早期红细胞前体细胞，即爆发式红细胞形成单位 (CFU-E)，是大型红细胞集落的来源，而更成熟的红细胞集落形成单位 (CFU-E) 是小型红细胞集落的来源。一般来说，当细胞在半固体培养基中生长时，可以识别出形成六种类型的髓系集落的细胞：CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M、BFU-E 和 CFU-E。

然而，除了造血衍生物之外，任何用于分离造血干细胞（HSC）的原料都含有大量的伴随细胞。为此，需要对移植物进行初步纯化，首先要从供体免疫系统的活性细胞中纯化。通常，为此使用免疫选择，基于淋巴细胞特异性抗原的表达，这使得可以使用单克隆抗体分离和去除这些抗原成为可能。此外，已经开发出一种用于骨髓移植T淋巴细胞耗竭的免疫玫瑰花结方法，该方法基于CD4+淋巴细胞和特异性单克隆抗体的复合物的形成，并通过单采有效去除。该方法可确保生产出含有40-60％造血干细胞的纯化细胞材料。

通过逆流离心，再经含有人免疫球蛋白包被的尼龙纤维柱过滤（在螯合剂柠檬酸三钠存在下），可以去除白细胞分离产物中成熟的血液成分，从而增加祖细胞的数量。这两种方法的顺序使用可确保移植物中的血小板完全纯化，红细胞纯化率达89%，白细胞纯化率达91%。由于造血干细胞（HSC）的损失显著减少，总细胞群中CD34+细胞的水平可提高至50%。

分离的造血干细胞在培养中形成成熟血细胞集落的能力可用于表征细胞的功能。对形成的集落进行分析可以识别和量化祖细胞的类型、其分化程度以及确定其分化方向。克隆形成活性是在甲基纤维素、琼脂、血浆或纤维蛋白凝胶等半固体培养基中测定的，这些培养基可降低细胞的迁移活性，防止其附着在玻璃或塑料表面。在最佳培养条件下，克隆可从单个细胞发育而来，耗时7-18天。如果一个克隆包含少于50个细胞，则将其标识为单个簇；如果细胞数量超过50个，则将其标识为集落。能够形成集落的细胞数量（集落形成单位 - CFU 或集落形成细胞 - COC）也将被考虑在内。需要注意的是，CFU 和 COC 的参数并不对应于细胞悬浮液中的 HSC 数量，尽管它们与 HSC 数量相关，这再次强调了在体外确定 HSC 功能（集落形成）活性的必要性。

在骨髓细胞中，造血干细胞具有最高的增殖潜能，因此它们在培养中能够形成最大的集落。这类集落的数量被认为可以间接决定干细胞的数量。作者在体外形成了直径超过0.5毫米、细胞计数超过1000个的集落后，测试了这些细胞对亚致死剂量5-氟尿嘧啶的抗性，并研究了它们在致死剂量辐射动物骨髓中重新植入的能力。根据指定的参数，分离出的细胞几乎与造血干细胞（HSC）难以区分，并被命名为HPP-CFC——具有高增殖潜能的集落形成细胞。

人们仍在不断探索更高质量造血干细胞的分离方法。然而，造血干细胞在形态上与淋巴细胞相似，是一组相对均质的细胞，其细胞核近乎圆形，染色质分散细密，胞浆少量，呈弱嗜碱性。它们的确切数量也难以确定。据推测，人类骨髓中的造血干细胞（HSC）的出现频率为每106个有核细胞中出现1个。

造血干细胞的鉴定

为了提高造血干细胞识别的质量，需要对膜结合抗原谱进行连续或同时（在多通道分选仪上）研究，并且在 HSC 中，CD34+CD38 表型应与线性分化标志物的缺失相结合，尤其是免疫活性细胞的抗原，例如 CD4、表面免疫球蛋白和血型糖蛋白。

几乎所有造血干细胞表型分析方案都涉及CD34抗原的测定。这种分子量约为110 kDa的糖蛋白，携带多个糖基化位点，在位于1号染色体上的相应基因激活后，在浆细胞膜上表达。CD34分子的功能与L-选择素介导的早期造血祖细胞与骨髓基质基础的相互作用有关。然而，需要注意的是，细胞表面存在CD34抗原仅能对细胞悬浮液中的造血干细胞(HSC)含量进行初步评估，因为其他造血祖细胞、骨髓基质细胞和内皮细胞也表达该抗原。

在造血祖细胞分化过程中，CD34 的表达会持续降低。红细胞、粒细胞和单核细胞定向祖细胞要么表达较弱的 CD34 抗原，要么在其表面完全不表达（CD34 表型）。分化的骨髓细胞和成熟血细胞的表面膜上检测不到 CD34 抗原。

值得注意的是，在造血祖细胞的分化过程中，不仅CD34的表达水平会下降，CD38抗原（一种分子量为46 kDa、具有NAD-糖基水解酶和ADP-核糖基环化酶活性的膜内糖蛋白）的表达也会逐渐增加，这表明其参与了ADP-核糖的运输和合成。因此，存在对造血祖细胞定向分化程度进行双重调控的可能性。CD34+CD38+表型的细胞群占CD34阳性骨髓细胞的90%至99%，其祖细胞增殖和分化潜力有限，而CD34+CD38表型的细胞则可以发挥造血干细胞（HSC）的作用。

事实上，以CD34+CD38-表示的骨髓细胞群包含相对大量的原始干细胞，这些干细胞能够向髓系和淋巴系分化。在长期培养CD34+CD38-表型的细胞的情况下，可以获得所有成熟的血液形成细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨核细胞、红细胞和淋巴细胞。

近期已证实 CD34 阳性细胞表达另外两种标记物 AC133 和 CD90（Thy-1），它们也用于识别造血干细胞。Thy-1 抗原与 CD117 受体（c-kit）在骨髓、脐带和外周血的 CD34+ 细胞上共表达。它是一种分子量为 25-35 kDa 的表面磷脂酰肌醇结合糖蛋白，参与细胞粘附过程。一些作者认为 Thy-1 抗原是最不成熟的 CD34 阳性细胞的标记物。具有 CD34+Thy-1+ 表型的自我繁殖细胞可产生长期培养系并形成子细胞。据推测，Thy-1 抗原可以阻断导致细胞分裂停滞的调节信号。尽管 CD34+Thy1+ 细胞具有自我繁殖和建立长期培养系的能力，但它们的表型不能完全归因于 HSC，因为 Thy-1+ 在 CD34 阳性细胞元素总量中的含量约为 50%，大大超过了造血细胞的数量。

更有望用于鉴定造血干细胞的标志物是AC133，它是造血祖细胞的抗原标记，其表达首次在胚胎肝细胞中检测到。AC133是一种跨膜糖蛋白，在造血干细胞（HSC）成熟的早期阶段出现在细胞膜表面——甚至可能比CD34抗原更早。A. Petrenko和V. Grishchenko（2003）的研究表明，高达30%的CD34阳性胚胎肝细胞表达AC133。

因此，根据目前的概念，造血干细胞的理想表型特征由细胞轮廓组成，其轮廓应包括 CD34、AC133 和 Thy-1 抗原的配置，但没有空间容纳 CD38、HLA-DR 和线性分化标记 GPA、CD3、CD4、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20 的分子投射。

造血干细胞（HSC）表型特征的一种变体可能是CD34+CD45RalowCD71low的组合，因为该公式描述的细胞特性与CD34+CD38表型细胞的功能参数并无差异。此外，人类造血干细胞（HSC）可以通过CD34+Thy-1+CD38Ilow/'c-kit/low的表型特征来识别——在接受致死性辐射的小鼠中，只有30个这样的细胞能够完全恢复造血功能。

造血干细胞（HSC）既能自我繁殖，又能分化成其他细胞成分，人们对造血干细胞（HSC）进行了长达40年的深入研究。研究始于对骨髓细胞一般表型特征的分析，这为通过骨髓移植治疗各种造血系统疾病提供了依据。后来发现的新型干细胞尚未在临床实践中得到广泛应用。与此同时，脐带血干细胞和胚胎肝干细胞不仅在血液学领域，而且在其他医学领域，由于它们在数量特征和质量特征上均与骨髓造血干细胞不同，因此能够显著扩大细胞移植的规模。

移植所需的造血干细胞通常来自骨髓、外周血、脐带血以及胚胎肝脏。此外，造血祖细胞可以通过体外扩增胚胎干细胞（ESC），然后定向分化为造血细胞因子来获得。A. Petrenko 和 V. Grishchenko（2003）正确地指出，不同来源的造血干细胞（HSC）在免疫学特性和造血功能恢复能力方面存在显著差异，这是由于其来源中早期多能祖细胞和晚期定向祖细胞的比例不同所致。此外，不同干细胞来源的造血干细胞的特征在于，非造血细胞的结合在数量和质量上完全不同。

骨髓已成为造血干细胞的传统来源。骨髓细胞悬液是在局部麻醉下通过冲洗从髂骨或胸骨获取的。由此获得的悬液是异质性的，包含造血干细胞 (HSC)、基质细胞成分、髓系和淋巴系的定向祖细胞以及成熟的血液形成成分。骨髓单核细胞中 CD34+ 和 CD34+CD38 表型的细胞数量分别为 0.5-3.6% 和 0-0.5%。G-CSF 诱导的造血干细胞动员后的外周血中 CD34+ 和 CD34+CD38 的比例分别为 0.4-1.6% 和 0-0.4%。

脐带血中免疫表型CD34+CD38和CD34+的细胞百分比较高——0-0.6%和1-2.6%，在胚胎肝造血细胞中检测到的数量最多——分别为0.2-12.5%和2.3-35.8%。

然而，移植材料的质量不仅取决于其中所含的 CD34+ 细胞的数量，还取决于它们的功能活性，这可以通过体内集落形成水平（致死性辐射动物的骨髓再植）和体外集落生长水平（半液体培养基中）来评估。结果表明，从胚胎肝脏、胎儿骨髓和脐带血中分离的 CD34+CD38 HLA-DR 表型的造血祖细胞的集落形成和增殖活性明显超过成人骨髓和外周血造血细胞的增殖和集落形成潜力。对不同来源的 HSC 进行定量和定性分析表明，它们在细胞悬浮液中的相对含量和功能能力存在显著差异。在从胎儿骨髓中获得的移植材料中发现了最大数量的 CD34+ 细胞（24.6％）。成人骨髓中CD34阳性细胞占2.1%。成人外周血单核细胞中，CD34+细胞仅占0.5%，而脐血中CD34+细胞数量高达2%。同时，胎儿骨髓CD34+细胞的克隆形成能力是成人骨髓造血细胞克隆生长能力的2.7倍，脐血细胞形成的克隆数量也显著高于从成人外周血中分离的造血细胞：分别为65.5个/105细胞和40.8个/105细胞。

造血干细胞增殖活性和集落形成能力的差异不仅与其成熟度不同有关，还与其天然微环境有关。已知干细胞的增殖强度和分化速度由多组分生长因子和细胞因子系统的整体调控作用决定，这些因子和细胞因子由干细胞自身及其基质微环境中的细胞成分产生。使用纯化的细胞群和无血清培养基进行细胞培养，可以鉴定对不同水平的干细胞、祖细胞以及定向分化的细胞具有刺激和抑制作用的生长因子。研究结果令人信服地表明，从不同个体发育水平来源获得的造血干细胞在表型和功能上均存在差异。处于个体发育早期的造血干细胞具有较高的自我复制潜力和增殖活性。此类细胞以较长的端粒为特征，并可定向形成所有造血细胞系。由于此类细胞HLA分子表达较弱，免疫系统对胚胎来源的造血干细胞（HSC）的反应较慢。造血干细胞的相对含量、自我更新能力以及它们所形成的定向细胞系数量存在明显的等级差异：胚胎肝脏CD34+细胞>脐带血CD34+细胞>骨髓CD34+细胞。重要的是，这种差异不仅存在于人类发育的出生内、新生儿期和出生后早期，也存在于整个个体发育过程中——从成人骨髓或外周血中获得的造血干细胞（HSC）的增殖和集落形成活性与供体的年龄成反比。