脐带血造血干细胞

脐带血因其增殖潜力和再生能力而成为造血干细胞的良好来源。大量研究表明，新生儿出生时脐带血中含有足够数量的弱定向造血祖细胞。一些作者认为，脐带血造血干细胞移植的优势在于无需寻找与HLA抗原相容的供体。他们认为，新生儿免疫系统发育不成熟会导致免疫活性细胞功能活性降低，因此严重移植物抗宿主病的发生率低于骨髓移植。同时，即使每公斤患者体重使用的造血干细胞数量较少，脐带血细胞移植的存活率也不低于骨髓细胞。然而，我们认为，对于在接受者体内有效植入所需的最佳移植脐带血细胞数量、其免疫相容性以及脐带血造血干细胞移植问题的许多其他方面的问题，需要进行更认真的分析。

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从脐带血中获取造血干细胞

从脐带血中提取造血干细胞的过程需要在婴儿出生后立即采集，并在胎盘宫内或宫外，以及剖宫产过程中（也可在宫外）将其从胎盘分离。研究表明，如果从出生到新生儿与胎盘分离的时间缩短至30秒，获得的脐带血量平均可增加25-40毫升。如果延迟进行此过程，则会损失相同量的血液。已证实，早期将婴儿与胎盘分离不会对新生儿造成任何负面影响。

俄罗斯血液学和输血学研究所开发了高效且低成本的脐带血采集技术，适用于正常分娩（（70.2+25.8）毫升）和剖宫产（（73.4+25.1）毫升）脐带血的采集。提出了一种分离脐带血的方法，可获得足够高的有核细胞和单核细胞产量，分别为（83.1+9.6）%和（83.4+14.1）%。改进了一种脐带血冷冻保存方法，可确保单核细胞和CFU-GM的保存率分别为（96.8+5.7）%和（89.6+22.6）%。确定了使用Kompoplast-300容器（俄罗斯）进行脐带血引流采集的效率。作者在胎儿出生并与胎盘分离后立即采集脐带血，胎盘置于宫内或宫外均可。在穿刺脐静脉前，用5％碘酊处理脐带一次，然后用70％乙醇处理两次。血液通过连接管自然流入容器。采集过程不超过10分钟。通过引流采集的66个脐带血样本平均体积为（72+28）ml，平均总样本体积中的白细胞数为（1.1+0.6）x 107。在对脐带血进行无菌分析（细菌污染、HIV-1、乙肝和丙肝病毒、梅毒和巨细胞病毒感染）时，仅在一份样本中检测到丙肝病毒的IgG抗体。在另一项研究中，胎儿出生后立即将胎盘置于特制框架上，胎面朝下，用 5% 碘溶液和 75% 乙醇处理脐带。用输血系统 (G16) 的针头引流脐静脉。血液自然流入容器。用这种方法采集的血液平均量为 (55+25) ml。在 G. Kogler 等人 (1996) 的研究中，他们用封闭方法采集脐带血，获得大量血液，平均 (79+26) ml。作者指出，在 574 份脐带血样本中，约 7% 的血液含量不足 40 ml，因此不能用于移植。K. Isoyama 等人(1996) 通过使用注射器主动输注来采集脐带血，平均获得 69.1 ml 血液（脐带血量从 15 ml 到 135 ml 不等）。最后，A. Abdel-Mageed PI 等人 (1997) 通过脐静脉导管术成功获得平均 94 ml 脐带血（从 56 ml 到 143 ml）。

为了降低医源性感染和母体分泌物污染的风险，我们基于美国伊利诺伊州迪尔菲尔德市百特医疗公司（Baxter Healthcare Corp.）广泛使用的输血系统，开发了一种封闭式血液采集系统，该系统含有62.5毫升的CPDA（柠檬酸-磷酸盐-葡萄糖加腺嘌呤）作为抗凝剂。采集血液的技术对于制备高质量的样本（包括细胞悬液的体积、含量和纯度）至关重要。现有的脐带血采集方法通常分为封闭式、半开放式和开放式，应优先选择半开放式，因为封闭式系统可以显著降低血液被微生物污染以及细胞悬液被母体细胞污染的风险。

A. Nagler 等人（1998）对三种脐带血采集系统的效率进行了比较分析。在第一种方案中，该过程在封闭系统中进行，直接将血液剥离到容器中。在第二种方案中，通过使用 MP1 注射器主动输血，然后冲洗胎盘静脉并同时将血液引流到容器中（开放式方法）来获取脐带血。在第三种方案中，通过半开放式系统采集血液，通过使用注射器主动抽取血液并将其通过脐动脉冲洗并同时将其引流到容器中。在第一种方案中，作者获得了（76.4+32.1）ml 的脐带血，每 ml 血液中的白细胞含量为（10.5+3.6） x 10 ^6。在第二种方案中，相应的指标分别为（174.4+42.8）ml 和（8.8+3.4） x 10 ⁶ /ml；第三组为（173.7+41.3）ml和（9.3+3.8）x 10 ⁶ /ml。在使用开放式系统采集脐带血样本时，感染最为常见。胎盘质量与采血量呈正相关——胎盘质量越大，采血量也越大。

脐带血采集后，接下来是分离阶段——分离单核细胞并从红细胞中纯化细胞悬液。在实验条件下，有核细胞是通过用氯化铵裂解红细胞时用甲基纤维素沉淀来分离的。然而，甲基纤维素不应用于临床，因为造血干细胞的损失率高达50-90%。由于工作溶液体积巨大，临床几乎从未进行过红细胞裂解，尽管通过这种方式分离CD34+表型的有核细胞以及具有CFU-GM和CFU-GEMM功能的祖细胞的比例明显较高。据报道，一种在密度梯度中分离单核细胞的新方法——buyant密度溶液(BDS72)应运而生。该物质的生理参数如下：pH 值 - 7.4，渗透压 - 280 mOsm/kg，密度 - 1.0720 g/ml。据作者称，它可用于分离高达 100% 的 CD34 阳性细胞，并去除 98% 的红细胞。然而，BDS72 尚未在临床上使用。

在从脐带血中分离有核细胞的现有方法中，通常使用10%羟乙基淀粉溶液或3%明胶溶液。这两种方法中，红细胞沉降和有核细胞分离的效率大致相同。然而，使用明胶作为沉降剂时，获得的CFU-GM量可能比使用羟乙基淀粉时略高。据推测，CFU-GM分离效率的差异是由于不同组分的有核细胞沉降速度不同，或羟乙基淀粉分子能够吸附在造血细胞受体表面，从而抑制其对体外培养CFU-GM所用集落刺激因子的敏感性。尽管如此，这两种沉降剂都可能适用于在建立大规模脐带血库时分离有核细胞。

脐带血的分离和冷冻保存方法与处理成人捐献者外周血和骨髓造血干细胞的方法基本相同。但当需要为脐带血库制备大量脐带血样本时，分离方法首先必须低成本。因此，遗憾的是，目前临床上仍使用已经过验证的常规脐带血细胞分离和冷冻保存方法，而更有效但成本更高的方法仍是实验者们的主流。

总体而言，评估造血细胞数量的标准以及对脐血样本进行感染病原体检测的要求已获得批准。为了确保脐血造血细胞移植的安全性，所有血液样本必须进行主要血源性感染和遗传性疾病检测。一些作者建议采用额外的特殊方法对脐血进行检测，以诊断遗传性疾病，例如α-地中海贫血、镰状细胞性贫血、腺苷脱氨酶缺乏症、布鲁顿无丙种球蛋白血症、赫尔勒病和庞特病。

根据L. Ticheli及其合著者（1998）的建议，每份脐带血样本均须进行有核细胞、CD34阳性细胞和CFU-GM检测，并进行HLA分型，并根据ABO血型及其Rh因子确定血型。此外，还必须进行细菌培养、HIV和巨细胞病毒感染、乙肝表面抗原（HBsAg）、丙型病毒性肝炎、HTLY-I和HTLV-II（人类T细胞白血病）、梅毒和弓形虫病的血清学检测。此外，还必须进行聚合酶链反应（PCR）检测巨细胞病毒和HIV感染。

脐带血采集程序必须严格遵循医学生物伦理学原则。采血前，必须征得孕妇的同意。所有操作，从输血到填写文件，都必须由医务人员进行，并事先与孕妇沟通，以获得孕妇的知情同意。任何情况下，生物、化学、药学或其他非医学专业背景的人员均不得执行上述任何操作，因为这违反了既定的生物伦理和人权规范。如果乙肝表面抗原（HBsAg）检测呈阳性，或存在丙型肝炎、艾滋病毒和梅毒病原体抗体，则不予采集脐带血，已采集的血液样本将被丢弃并销毁。需要注意的是，新生儿携带潜伏感染的可能性远低于成人，因此，输注脐带血造血细胞发生血源性传播和发生感染并发症的可能性显著低于使用成人供体骨髓进行移植的情况。

脐带血临床应用的一个重要方面是移植评估，其基础是确定脐带血样本中的造血干细胞数量以及移植所需的细胞剂量。目前，尚未制定移植所需脐带血细胞的最佳数量标准。即使是CD34阳性细胞和CFU-GM等常规参数，也没有普遍接受的观点。一些作者通过分析长期培养物中粒细胞、红细胞、单核细胞和巨核细胞共有的集落形成单位（CFU-GEMM）的含量来评估造血细胞的潜力。

然而，在临床环境中，脐带血移植的标准评估通常仅涉及确定有核细胞或单核细胞的数量。

脐带血造血干细胞的储存

脐带血造血细胞的保存技术也存在一些问题。冻存造血干细胞时，为了达到最佳的冻存模式，需要尽可能减少脐带血的体积，同时需要提前去除红细胞，以避免溶血和发生红细胞抗原（ABO、Rh）不相容反应的风险。各种有核细胞分离方法均适用于这些目的。上世纪90年代初，最广泛使用的方法是基于密度为1.077 g/ml的Ficoll或密度为1.080 g/ml的Percoll在密度梯度中分离有核细胞。以密度梯度分离脐带血可以分离出主要的单核细胞，但会导致造血祖细胞的大量损失 - 高达 30-50%。

在分离脐带血造血细胞的过程中，羟乙基淀粉的沉降效率存在不同的评估。一些作者指出该方法的分离质量较低，而另一些研究人员则相反，在所有可能的方法中，更倾向于使用6%羟乙基淀粉溶液分离脐带血造血干细胞(HSC)。同时，他们也强调了造血细胞沉降的高效率，根据一些数据，其效率可达84%至90%。

持不同观点的人认为，几乎所有的分离方法都会导致大量有核细胞的损失，并建议通过离心进行分离，将脐带血分成3个部分：红细胞、白细胞环和血浆。通过这种方式分离细胞，作者发现单核细胞、早期造血祖细胞和CD34+免疫表型细胞的含量最终分别达到了初始水平的90%、88%和100%。其他研究人员也获得了类似的脐带血细胞纯化增幅值：沉淀后，分离出92%的有核细胞、98%的单核细胞、96%的CD34阳性细胞和106%的集落形成单位。

20世纪90年代末，明胶被广泛用作沉降剂。自1994年以来，临床上已开始使用明胶从脐带血中分离造血干细胞。使用3%明胶溶液，有核细胞分离效率可达88-94%。明胶在脐带血库建设中的大规模应用，已证实其优于其他沉降剂。对上述所有方法在对每个受试脐带血样本依次使用条件下分离有核细胞的效率进行比较分析，结果表明，就CD34+/CD45+表型单核细胞的产量以及CFU-GM和CFU-GEMM的数量而言，3%明胶溶液是最佳的沉降剂。使用 Ficoll 密度梯度的方法以及使用羟乙基淀粉和甲基纤维素的方法效果明显较差，造血细胞损失高达 60%。

脐带血干细胞移植量的扩大不仅与其采集方法的改进有关，还与其储存方法的改进有关。许多问题与脐带血的长期储存准备以及样本冷冻保存的最佳技术选择直接相关。其中包括实施分离程序的可行性、使用各种冷冻保存介质以及应用解冻细胞移植方法的问题。天然脐带血样本的运输通常来自远离血液学中心的地区。因此，脐带血从采集到开始冷冻保存的可接受储存期问题就随之而来，这在建立脐带血库时尤为重要。

脐带血在液氮中长期保存（长达12年）后造血细胞功能活性的研究表明，在此期间约有95%的造血细胞不会失去其高增殖能力。S. Yurasov等人（1997年）的研究表明，脐带血在室温（22℃）或4℃下保存24和48小时不会显著降低造血细胞的活力，分别为初始水平的92%和88%。但是，如果保存期延长至三天，脐带血中存活的有核细胞数量会显著减少。同时，其他研究表明，在22或4℃下保存2-3天时，成熟粒细胞而不是造血细胞的活力首先受到影响。

脐带血采集系统的组件可能会对脐带血造血干细胞的活力产生负面影响。通过分析各种基于钙离子结合机制的抗凝剂（ACD、EDTA、XAPD-1）对脐带血储存24至72小时的造血祖细胞的影响，发现它们对有核细胞活力有负面影响。为此，作者建议使用添加了天然肝素且不含防腐剂的PBS（磷酸盐缓冲液），浓度为20 U/ml，他们认为这可以将未分级脐带血的储存期延长至72小时，并保持集落形成单位的功能活性。然而，对CFU-GM和CFU-G安全性的研究表明，脐带血在冷冻保存前的储存时间不应超过9小时。显然，在这种情况下应该适用的原则是，在存在冲突的数据的情况下，应该使用脐带血建议的最短储存期，并尽快开始对分离的细胞进行程序化冷冻。

冷冻脐带血造血干细胞时，通常使用10% DMSO溶液作为冷冻保护剂。然而，除了显著的冷冻保护作用外，这种浓度的二甲基亚砜即使对脐带血造血细胞的暴露量极小，也具有直接的细胞毒性。为了降低DMSO的细胞毒性作用，应使用零暴露温度，提高所有操作速度，并在脐带血样本解冻后进行多次清洗。

自1995年以来，乌克兰医学科学院血液学和输血学研究所一直致力于发展一项科学方向，旨在全面研究脐带血作为造血干细胞替代来源。特别是，他们开发了用于低温冷冻保存未分级和分级脐带血造血细胞的新技术。低分子医用聚乙烯吡咯烷酮被用作冷冻保护剂。未分级脐带血的冷冻保存方法基于独特的细胞预处理技术和移植前细胞悬浮液的特殊处理方法。

影响冷冻保存造血干细胞功能活性水平的最重要因素之一是细胞悬浮液的冷却速度，尤其是在结晶阶段。一种解决冷冻速度和时间问题的软件方法为创建简单高效的冷冻保存方法提供了巨大的机会，无需在移植前从冷冻保护剂中清洗细胞悬浮液。

在细胞制备过程中，对其活力最危险的阶段是直接冻融阶段。冷冻造血细胞时，细胞间介质从液态转变为固相（即结晶）时，其中很大一部分可能会被破坏。为了降低细胞死亡率，人们会使用冷冻保护剂，其作用机制和冷冻保护效率已在科学文献中得到充分阐述。

优化骨髓和脐带血细胞冷冻保存方法的一个有希望的方向是将几种具有不同作用机制的低浓度冷冻保护剂组合在一种溶液中，例如作用于细胞内水平的 DMSO 和具有细胞外保护作用的羟乙基淀粉或白蛋白。

脐带血细胞的冷冻保存通常使用20%的二甲基亚砜（DMSO）溶液，在冰浴中持续机械搅拌下，缓慢倒入细胞悬浮液中，直至冷冻保护剂与细胞悬浮液体积比达到1:1。二甲基亚砜的最终浓度为10%。然后，将细胞悬浮液放入程序化低温装置中，以GS/min的速率冷却至-40°C，之后冷却速率增加到10°C/min。达到-100°C后，将装有细胞悬浮液的容器放入液氮（-196°C）中。采用这种冷冻保存技术，解冻后功能活性单核细胞的保存率可达到原始水平的85%。

改进的冷冻保存方法旨在通过添加羟乙基淀粉来降低DMSO的浓度（二甲基亚砜和羟乙基淀粉的最终浓度分别为5%和6%）。在冷冻髓系细胞悬浮液时，观察到这种冷冻保护剂组合的高效性，且其细胞保护效果不亚于仅使用10%二甲基亚砜溶液。活核细胞数量达到初始水平的96.7%，其功能活性（以CFU-GM数量估算）为81.8%。

当使用浓度为 5% 至 10% 的二甲基亚砜溶液与 4% 羟乙基淀粉（最终浓度）组合时，发现在此范围的二甲基亚砜中 CD34 阳性细胞的安全性几乎保持不变。同时，当二甲基亚砜浓度从 5% 降至 2.5% 时，会观察到脐带血细胞大量死亡 - 活细胞单位数量从 85.4 减少到 12.2%。其他作者也得出结论，在脐带血 HSC 的冷冻保存过程中，5% 和 10% 二甲基亚砜溶液（作者的说法是与自体血清组合）可提供最有效的细胞保护。此外，在 5% 或 10% 二甲基亚砜与 4% 羟乙基淀粉溶液组合的情况下，尤其是在控制冷却速度为 GS/min 的情况下，可以很好地保存连续冷冻和解冻的细胞。另一项研究采用了由三种成分——DMSO、纯化人血白蛋白和RPMI培养基（比例为1:4:5）组成的冷冻保护液，将其以等体积比例加入到细胞悬液中（二甲基亚砜的最终浓度为5%）。在+4 GS水浴中解冻后，CFU-GM的保存率超过94%。

一些作者建议使用未分级脐带血进行冷冻保存，因为在去除红细胞的过程中会损失大量造血细胞。在这种方法中，使用10%的二甲基亚砜溶液来保护单核细胞免受冷冻结晶的损伤。以每分钟1000转的恒定冷却速率冷冻至-80°C，然后将脐带血细胞悬液放入液氮中。这种冷冻方法会导致红细胞部分裂解，因此血液样本无需分级。解冻后，用人血白蛋白溶液或患者自体血清洗脱细胞悬液中的游离血红蛋白和二甲基亚砜，然后用于移植。

未分级脐带血解冻后造血祖细胞的保存率确实高于分级脐带血，然而，由于某些红细胞的冷冻稳定性，输注ABO血型不合的红细胞可能会引发严重的输血后问题。此外，未分级血液的储存量也会显著增加。从临床角度来看，冷冻保存先前从其他细胞组分中分离纯化的脐带血造血细胞仍然是更可取的。

具体而言，我们开发了一种用于分离脐带血细胞的冷冻保存方法，该方法允许在冷冻准备阶段去除红细胞，其中使用6%羟乙基淀粉溶液作为血浆替代溶液“Stabizol”的一部分。解冻后，以这种方式获得的细胞悬浮液无需额外操作即可用于临床。

因此，目前脐带血冷冻保存的方法有很多，效果都比较有效。它们的根本区别在于，血液样本未经分级冷冻，或者在制备阶段就分离成细胞级分，制备不含红细胞的有核细胞。

脐带血造血干细胞移植

20世纪80年代末90年代初，人们发现脐带血富含造血干细胞，可为妊娠期胎儿提供生命支持。脐带血细胞获取相对简单，且不存在明显的伦理问题，这促进了脐带血干细胞在实际医学中的应用。首例脐带血移植成功应用于范康尼贫血症患儿，为扩大脐带血干细胞移植数量和建立脐带血库奠定了基础。全球脐带血库系统中，规模最大的是纽约胎盘血液中心，该中心隶属于美国国立卫生研究院。该中心储存的脐带血样本数量接近2万份。接受成功移植的接受者（主要为儿童）数量也在不断增长。据美国卫生部统计，脐带血移植接受者的移植后无复发生存期已超过10年。

这并不奇怪，因为大量关于脐带血造血潜能的研究表明，就最早干细胞的数量和质量而言，它不仅不逊色于成人骨髓，甚至在某些方面甚至有所超越。脐带血干细胞更高的增殖潜能得益于其细胞信号传导的个体发育特征、造血干细胞（HSC）上存在特定生长因子受体、脐带血细胞能够自分泌生长因子，以及端粒较大且较长。

因此，脐带血造血干细胞的基因组和表型特征预先决定了移植的高质量植入，并具有在接受者体内恢复供体造血功能的巨大潜力。

脐带血造血干细胞的益处

与其他造血细胞来源相比，使用脐带血造血干细胞进行移植具有诸多实际优势，其中值得注意的是，它对捐献者的健康几乎为零风险（如果不考虑胎盘本身）并且无需全身麻醉。由于移植的移植对象为部分 HLA 相容（一至三种抗原不相容），脐带血的使用扩大了细胞移植的可能性。目前已开发出一种将脐带血造血细胞长期冷冻保存的方法，这增加了获得稀有 HLA 类型的可能性，并减少了寻找用于异基因移植的 HLA 相容移植的时间。同时，感染某些潜在传染性疾病的风险也显著降低。此外，由于可以使用脐带血细胞进行自体移植，因此也产生了一种廉价的生物人寿保险形式。

然而，由于从胎盘中采集的血液量很少（平均不超过100毫升），因此，在严格遵守所采集脐带血样本细菌污染风险最小的条件下，从脐带静脉获取最大尽可能量的血液的问题就显得尤为突出。

脐带血原始造血细胞通常通过其表面CD34糖磷蛋白的存在来识别，也可通过研究其体外克隆形成能力或集落形成能力来判断其功能特性。比较分析表明，脐带血和骨髓中CD34阳性细胞在单核细胞级分中的最大含量分别为1.6%和5.0%，CD34+细胞亚群中集落形成单位的最大水平分别为80%和25%，CD34+细胞的总克隆效率分别为88%和58%，具有高增殖潜能的集落形成细胞（CD34+细胞群中的HPP-CFC）的最大含量分别为50%和6.5%。值得补充的是，脐带血造血干细胞的CD34+CD38细胞克隆效率和对细胞因子刺激的反应能力也较高。

Thy-1、CD34 和 CD45RA 表型抗原的组合证实了脐带血造血细胞的高增殖潜能，这三种抗原在脐带血细胞表面的表达表明它们属于干细胞。此外，研究发现脐带血中含有 CD34+ 表型的细胞，这些细胞不具有线性分化的标志。脐带血中具有 CD34+/Lin 表型特征的细胞亚群约占 CD34 阳性细胞总数的 1%。脐带血造血祖细胞既能分化为淋巴细胞系，也能分化为具有线性细胞分化的多能性髓系细胞，这也表明它们属于干细胞。

如前所述，骨髓和脐带血的显著差异在于一次采集过程中用于移植的造血细胞数量。如果说骨髓移植在分离、冷冻保存、解冻和检测过程中的细胞质量损失在40%-50%之间是可以接受的，那么对于脐带血来说，这种细胞损失就非常显著，因为如果使用的造血干细胞数量不足，移植可能会无效。根据G. Kogler等人（1998）的研究，对于体重10公斤的接受者进行细胞移植，所有脐带血样本（采集的脐带血样本总数为2098个）都可能成为移植对象，体重35公斤的患者中，只有25%的样本能够有效移植，而体重50-70公斤的患者中，只有25%的样本能够有效移植。这种临床情况表明，需要优化和提高现有脐带血细胞采集、复制和储存方法的效率。因此，目前文献中广泛讨论了规范脐带血的采集、检测、分离和冻存方法，建立血库，在临床上的应用，并规定了脐带血造血干细胞的储存条件和条款。

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脐带血造血干细胞的医学用途

^{通常从脐带血中可以分离出多达 106 个}造血干细胞，很少更多。在这方面，如此数量的脐带血造血细胞是否足以恢复成年接受者的造血功能，这个问题至今仍未得到解答。对这个问题的意见不一。一些研究人员认为，这样的数量对于移植给儿童来说是足够的，但对于移植给成年人来说太少了，对成年人来说，最佳的量是每 1 公斤体重引入 (7-10) x 106^个CD34 阳性细胞——平均每次移植 7 x 108^个。从这些计算中可以得出，一个脐带血样本所含的造血干细胞比移植给成年患者一次所需的数量少 700 倍。然而，这种定量评估是通过类比输入的骨髓细胞数量进行的，根本没有考虑到造血的个体发育特征。

尤其忽略了脐带血造血干细胞比骨髓造血祖细胞具有更高的增殖潜力这一事实。体外集落形成潜力研究的结果表明，一剂脐带血即可重建成年受体的造血功能。另一方面，不应忘记，脐带血干细胞的数量即使在胚胎发育过程中也会减少：从妊娠20周（本研究的血液是在妊娠提前终止期间采集的）到妊娠40周（生理分娩期），脐带血中CD34阳性细胞的含量线性下降5倍，同时伴随线性细胞分化标志物的表达持续增加。

由于缺乏标准化的脐带血样本中祖细胞的定量测定方法，关于脐带血造血干细胞最佳剂量的争论仍在继续。一些研究人员认为，根据接受者的体重重新计算的有核细胞和单核细胞的数量（即其剂量）可作为选择脐带血样本的标准。一些作者认为，即使是 HSC 自体移植，CD34+ 细胞的最低定量阈值也是 2 x 10 ⁶ /kg。同时，将造血细胞剂量增加到 5 x 10 ⁶细胞/kg（仅为 2.5 倍）已经可以确保移植后早期更良好的治疗过程，降低感染并发症的发生率并缩短预防性抗生素治疗的时间。

根据 E. Gluckman 等人 (1998) 的研究，在肿瘤血液学中，脐带血细胞移植成功的条件是每 1 kg 接受者体重至少输入 3.7 x 10 ^{7 个有核细胞。当造血干细胞的剂量降至每 1 kg 患者体重 1 x 107 个}或更少有核细胞时，移植失败和血癌复发的风险会急剧增加。应该认识到，同种异体移植 HSC 后快速恢复造血所需的最小祖细胞数量仍然未知。理论上，使用一个细胞即可实现这一点，但在骨髓移植的临床实践中，每 1 kg 患者体重输入至少 (1-3) x 10 ^{8 个有核细胞才能保证快速稳定的植入。}

近期一项旨在确定肿瘤血液学中最佳造血干细胞数量（HSC）的详细研究，包括观察三组患者，根据移植材料中CD34阳性细胞的含量进行分组。第一组患者接受(3-5) x 10 ^{6 个}细胞/kg的HSC移植。第二组患者接受(5-10) x 10 ^{6 个}细胞/kg的HSC移植，第三组患者接受超过10 x 10 ^{6 个}CD34+细胞/kg的移植。接受CD34阳性细胞数量为(3-5) x 10 ⁶ /kg的移植的患者组获得了最佳效果。当移植细胞剂量增加到5 x 10 ⁶ /kg以上时，并未显示出统计学上显著的优势。在这种情况下，移植的造血干细胞（HSC）含量过高（> 10 x 10 ⁶ /kg）会导致大量残留肿瘤细胞的回输，从而导致疾病复发。移植的同种异体祖细胞数量与移植物抗宿主反应的发生之间的直接关系尚未确定。

全球脐带血移植的丰富经验证实了其极高的再增殖潜力。脐带血移植的植入率与引入的有核细胞数量相关。最佳移植剂量为3 x 10 ⁷ /kg，而骨髓移植剂量为2 x 10 ⁸ /kg。根据协调中心的数据，截至2000年底，全球共进行了1200例脐带血细胞移植，主要来自亲属捐献者（83%）。显然，对于成血细胞增多症患者，脐带血应被视为骨髓移植的替代方案。

同时，脐带血组织来源的新生儿特性令人乐观，因为其造血干细胞（HSC）具有功能性特征。然而，只有临床经验才能解答一个脐带血样本是否足以恢复患有造血发育不全的成年受体的造血功能。脐带血细胞移植用于治疗多种肿瘤和非肿瘤疾病：白血病和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤和神经母细胞瘤、再生障碍性贫血、先天性范康尼贫血和戴蒙德-布莱克凡贫血、白细胞粘附缺陷症、巴尔综合征、冈瑟病、赫勒综合征、地中海贫血。

脐带血造血细胞移植的免疫学方面值得密切关注并开展单独研究。研究表明，对于来自HLA不完全相容性的供体的脐带血干细胞移植，移植结果相当令人满意，作者认为这表明脐带血细胞的免疫反应性低于骨髓。

对脐带血细胞组成的详细研究揭示了免疫系统效应细胞的表型谱及其功能活性特征，这使得脐带血可以被视为造血干细胞（HSC）的来源，且发生“移植物抗宿主”反应的风险相对较低。脐带血免疫活性细胞功能不成熟的迹象包括细胞因子产生失衡以及对细胞因子调节免疫反应的敏感性降低。由此导致的细胞毒性淋巴细胞活性抑制被认为是导致移植造血组织免疫耐受形成的一个因素。与成年供体的外周血和骨髓相比，脐带血淋巴细胞群中以非活性、未成熟淋巴细胞和抑制细胞为主。这表明脐带血T淋巴细胞对免疫反应的准备程度较低。脐带血单核细胞群的一个重要特征是功能成熟且活跃的抗原呈递细胞含量低。

一方面，脐带血中免疫系统效应细胞的成熟度较低，这扩大了其在临床上的应用，因为这些特性可以降低供体和受体细胞之间免疫冲突的强度。但另一方面，已知“移植物抗宿主”反应的发展程度与移植的抗肿瘤作用，即“移植物抗白血病”效应的发展之间存在相关性。为此，对脐带血细胞的抗肿瘤细胞毒性进行了研究。结果表明，尽管免疫功能正常的脐带血细胞对抗原刺激的反应确实较弱，但主要被激活的淋巴细胞是自然杀伤细胞和杀伤样细胞，它们积极参与抗肿瘤细胞毒性的实现机制。此外，在脐带血中发现了具有 CD16+CD56+ 和 CD16"TCRa/p+ 表型的淋巴细胞亚群。据推测，这些细胞在其活化形式下执行“移植物抗白血病”反应。

乌克兰医学科学院肿瘤研究所向因化疗和放疗而出现持续性造血功能低下的癌症患者注射了冷冻保存的脐带血造血干细胞。在这些患者中，移植脐带血造血干细胞非常有效地恢复了受到抑制的造血功能，这表现为外周血中成熟有形成分含量的持续增加，以及表征细胞和体液免疫状态的指标的提高。脐带血造血细胞移植后恢复效果的稳定性允许继续进行放疗和化疗而无需中断疗程。有资料显示，对肿瘤血液病患者进行脐带血干细胞异体移植的效率更高：使用脐带血干细胞的患者肿瘤疾病年复发风险为 25%，而移植异体骨髓的患者则为 40%。

脐带血干细胞冻存的作用机制应被认为是由于新生儿细胞具有自分泌产生造血生长因子的独特能力而引起的对接受者造血的体液刺激，以及供体细胞暂时植入的结果（输血后第7-15天，接受者外周血中胎儿血红蛋白含量与初始数据相比有可靠的增加，证明了这一点）。脐带血接受者未出现输血后反应，这是其免疫活性细胞相对耐受的结果，也是对冻存材料生物学充分性的置信标准。

脐带血T淋巴细胞杀伤祖细胞能够在外源性细胞因子刺激下被激活，这可用于开发新的体外和体内方法，以诱导移植淋巴成分的抗肿瘤细胞毒性，从而用于后续的免疫治疗。此外，脐带血免疫活性细胞基因组的“不成熟”使其能够通过分子建模方法增强抗肿瘤活性。

如今，脐带血已广泛应用于儿科血液学。对于急性白血病患儿，与骨髓异体移植相比，脐带血造血干细胞异体移植显著降低了移植物抗宿主病的发病率。然而，这种移植伴随较长时间的中性粒细胞和血小板减少症，并且不幸的是，术后100天死亡率较高。外周血中粒细胞和血小板水平恢复时间较长，可能是由于CD34阳性脐带血细胞各个亚群分化不足，其对放射性罗丹明的吸收水平较低，且其表面CD38抗原表达水平较低。

同时，由于缺乏合适的非亲缘骨髓供体，且无法动员自体造血干细胞，因此向成年患者移植脐带血造血干细胞，在30岁以下患者中显示出较高的一年无复发生存率（73%）。而当接受者的年龄范围扩大（18-46岁）时，生存率下降至53%。

对骨髓和脐带血中CD34+表型细胞的定量分析表明，骨髓中CD34+表型细胞的含量较高（3.5倍），但脐带血中CD34+HLA-DR表型细胞的含量明显较高。已知具有免疫标记CD34+HLA-DR的血细胞比具有免疫表型CD34+HLA-DR+的细胞增殖更活跃，这已在体外长期造血细胞培养生长实验中得到证实。脐带血和骨髓中均含有CD34+CD38表型的原始细胞前体，但具有标记组CD34+CD38的脐带血细胞比从成年供体骨髓中分离的相同表型的造血细胞具有更高的克隆形成活性。此外，具有 CD34+CD38 免疫表型的脐带血细胞在细胞因子刺激（IL-3、IL-6、G-CSF）下增殖速度更快，在长期培养中产生的菌落数量是骨髓细胞的 7 倍。

脐带血干细胞库

为了正确发展脐带血干细胞移植这一实用医学新领域以及实施骨髓造血干细胞移植，建立一个广泛的血库网络至关重要，目前美国和欧洲已经建立了这样的血库网络。国内脐带血库网络由脐带血库协会联合起来。建立国际脐带血库协会的必要性在于，进行无关移植需要大量已配型的脐带血样本，以便选择 HLA 相合的捐献者。只有建立储存各种 HLA 型别血液样本的血库系统，才能真正解决找到所需捐献者的问题。建立这样的脐带血库系统需要预先制定伦理和法律规范，目前国际上正在就此进行讨论。

为了在乌克兰建立脐带血库，必须制定一系列法规和文件。

首先，脐带血采集、分离和冷冻方法的标准化问题。有必要根据医学伦理要求，规范妇产医院脐带血采集规则，确定确保移植成功的最低脐带血量。有必要比较和规范评估造血祖细胞质量和数量的各种标准，以及HLA分型方法和脐带血细胞输注过程中可能传播的遗传性疾病和传染病的诊断方法，以建立选择健康捐献者的通用标准。此外，还值得探讨建立用于储存脐带血血清、细胞和DNA的独立设施。

建立一个脐带血数据计算机网络，与骨髓捐献者登记处对接，是绝对必要的。为了进一步发展细胞移植学，有必要制定专门的方案，用于比较来自HLA相合亲属和非亲属捐献者的脐带血和骨髓移植结果。标准化的记录，包括父母的知情同意，以及告知母亲或亲属孩子所发现的遗传和/或传染病，有助于解决脐带血细胞临床应用的伦理和法律问题。

乌克兰细胞移植学发展的决定性条件是采用国家干细胞捐赠计划并通过世界骨髓捐赠协会（WMDA）、美国国家骨髓捐赠计划（NMDP）和其他登记机构与其他国家开展国际合作。

回顾脐带血造血干细胞移植发展历程，我们可以看到，早在70年代初，人们就提出了脐带血可用于临床的设想，并在80年代通过动物实验研究的结果得到了证实。1988年，世界上首例脐带血造血细胞移植手术问世，此后，全球脐带血库网络开始建立。10年间，接受脐带血造血细胞移植的患者人数已接近800人。其中包括患有各种肿瘤（白血病、淋巴瘤、实体瘤）和非肿瘤（先天性免疫缺陷、贫血、代谢紊乱相关疾病）的患者。

脐带血中早期和定向细胞前体的含量高于成人外周血。就粒细胞-巨噬细胞集落形成单位的数量及其增殖潜能而言，即使添加了生长因子，脐带血也显著超过成人外周血。在体外长期细胞培养中，脐带血细胞的增殖活性和活力已超过骨髓细胞。脐带血干细胞移植的关键因素包括有核细胞的数量和造血潜能、是否存在巨细胞病毒感染、供者和接受者的HLA相容性、患者的体重和年龄。

然而，脐带血干细胞移植应被视为治疗严重血液疾病（尤其是儿童）的骨髓移植替代方案。脐带血细胞移植的临床问题正在逐步得到解决——目前已有相当有效的脐带血细胞采集、分离和冷冻保存方法，脐带血库的建立条件正在创造，有核细胞的检测方法也在不断改进。在大规模采集脐带血造血干细胞并建立脐带血库时，应考虑以3%明胶溶液和6%羟乙基淀粉溶液作为分离的最佳溶液。

P. Perekhrestenko 及其合著者（2001）正确地指出，脐带血干细胞移植应在治疗各种原因引起的造血功能低下的综合治疗措施中占据应有的地位，因为脐带血干细胞具有许多显著的优势，其中最重要的是获取相对简单、捐献者无风险、新生儿细胞病毒污染程度低以及移植成本相对较低。一些作者指出，脐带血细胞移植发生移植物抗宿主反应并发症的几率低于骨髓细胞移植，他们认为这是由于脐带血细胞HLA-DR抗原表达较弱且尚未成熟。但脐带血中有核细胞的主要群体是T淋巴细胞（CD3阳性细胞），其含量约为50％，比成人外周血少20％，但这些来源的T细胞亚群的表型差异并不显著。

在直接影响脐带血造血干细胞移植存活率的因素中，值得注意的是患者的年龄（1至5岁接受者的移植效果最佳）、疾病的早期诊断以及白血病的类型（急性白血病的疗效显著更高）。有核脐带血干细胞的剂量及其与接受者的HLA相容性也至关重要。脐带血造血干细胞移植在肿瘤血液学中的临床疗效分析显示，使用亲缘移植的治疗效果最佳，这并非巧合：在这种情况下，一年无复发生存率达到63%，而非亲缘移植仅为29%。

因此，脐带血中存在大量干细胞且新生儿造血干细胞具有很高的再增殖能力，可用于肿瘤血液病患者的异基因移植。然而，值得注意的是，脐带血造血细胞移植后造血功能的恢复“时间延长”：外周血中性粒细胞含量的恢复通常要到第 6 周结束时才能观察到，血小板减少症通常在 6 个月后消失。此外，脐带血造血细胞的不成熟并不能排除免疫冲突：23% 的接受者会出现严重的急性和慢性移植物抗宿主病，26% 的病例在脐带血细胞移植后第一年年底会出现急性白血病复发。

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