晶体沉积在骨关节炎发病机制中的作用

30% 至 60% 的骨关节炎患者滑液中可发现碱性磷酸钙 (BCP) 晶体。根据 A. Swan 等人 (1994) 的研究，大量骨关节炎患者的滑液中可发现含钙晶体；然而，由于这些晶体体积极小或数量极少，常规技术无法识别。滑液中存在 BCP 晶体与关节软骨退变的 X 射线影像学征象相关，并且与积液量大于无晶体的膝关节积液相关。一项关于影响膝关节病 X 射线影像学进展因素的研究表明，焦磷酸钙二水合物 (CPPD) 晶体的沉积是不良临床和 X 射线影像学结果的预测因素。一项针对老年患者的研究发现，骨关节炎与软骨钙化症相关，尤其是在膝关节外侧胫股关节和前三个掌指关节。骨关节炎患者体内同时存在两种类型的晶体（OFC 和 PFC），这种情况并不少见。

临床上，钙晶体沉积引起的关节软骨退变与原发性骨关节病的退变不同。如果晶体是软骨退变的简单附带现象，那么它们应该出现在原发性骨关节病最常影响的关节中，即膝关节、髋关节和手部小关节。相反，晶体沉积疾病最常影响原发性骨关节病不典型的关节，例如肩关节、腕关节和肘关节。关节液（渗出液）中存在晶体与更严重的关节软骨退变有关。晶体沉积和软骨退变哪个是因，哪个是果，目前尚有争议。以下假设处于中间位置：软骨代谢的原发性异常导致其退变，而晶体的继发性沉积加速其降解（所谓的放大环路理论）。

钙晶体损伤关节软骨的确切机制尚不清楚，现总结如下。理论上，钙晶体可能直接损伤软骨细胞。然而，组织学检查很少发现晶体靠近软骨细胞，更罕见的是晶体被软骨细胞吞噬。最可能的机制是滑膜内衬细胞吞噬晶体，随后释放蛋白水解酶或分泌细胞因子，刺激软骨细胞释放酶。一项关于PFKD诱发的滑膜炎在焦磷酸盐关节病中快速进展性骨关节炎发展中的作用的研究支持了这一观点。在本研究中，每周向因部分外侧半月板切除术诱发骨关节炎的兔子的右膝注射焦磷酸钙二水合物晶体（1 或 10 毫克）。结果表明，注射 8 次后，右膝关节的病变明显重于左膝。滑膜炎症的强度与关节内注射焦磷酸钙二水合物晶体的剂量及其剂量相关。尽管本研究中使用的CPPD晶体剂量超过了体内剂量，但结果提示CPPD诱发的炎症在焦磷酸盐关节炎骨关节炎进展中发挥了作用。

含钙晶体诱发关节软骨损伤的潜在机制与其有丝分裂特性、诱导MMP和刺激前列腺素合成的能力有关。

含钙晶体的促有丝分裂作用。在晶体相关关节病中，滑膜衬里细胞增生的情况较为常见，而晶体本身仅是这一过程的部分原因。滑膜细胞数量的增加伴随着细胞因子分泌的增加，这些细胞因子会促进软骨溶解并诱导蛋白水解酶的分泌。在人类关节病变中发现的浓度的OFC晶体会剂量依赖性地刺激静息皮肤成纤维细胞培养物以及犬和小鼠滑膜成纤维细胞的有丝分裂。焦磷酸钙二水合物、尿酸盐、硫酸盐、碳酸盐和磷酸钙晶体可刺激细胞生长。与血清刺激细胞相比，这些晶体诱导的( ^3H )-胸苷掺入的开始和峰值时间偏移了3小时。这段时间可能是吞噬和溶解晶体所必需的。添加相同大小的对照晶体（例如钻石粉或乳胶颗粒）不会刺激有丝分裂。一水尿酸钠晶体的有丝分裂活性较弱，明显低于尿酸钙，这表明晶体中钙含量在有丝分裂活性中的重要性。合成的OFC晶体具有与从软骨钙质沉着症患者体内获得的晶体相同的有丝分裂活性。含钙晶体的有丝分裂活性并非由体外周围培养基中钙含量的增加所致，因为碱性磷酸钙晶体在培养基中溶解不会刺激成纤维细胞吸收( ^3H )-胸苷。

OFC 诱导有丝分裂的一种假设机制是，异常的滑膜细胞增殖可能至少部分归因于晶体的内吞作用和细胞内溶解，这会增加细胞质 Ca ²⁺浓度并激活导致有丝分裂发生的钙依赖性途径。这一概念得到了刺激有丝分裂需要细胞与晶体直接接触的支持，因为细胞培养物暴露于晶体会诱导细胞生长，而缺乏这种接触的细胞则不会。为了研究细胞与晶体相互作用后晶体吞噬的必要性，将细胞与⁴⁵ Ca-OPC 和 ( ^3H )-胸苷一起培养。结果发现，含有⁴⁵ Ca-OPC 的细胞比没有碱性磷酸钙标记的细胞吸收更多的 ( ^3H )-胸苷。在巨噬细胞培养中，细胞松弛素对晶体内吞作用的抑制导致晶体溶解的抑制，进一步强调了吞噬作用的必要性。

含钙晶体可溶于酸。吞噬后，晶体溶解于巨噬细胞吞噬溶酶体的酸性环境中。氯喹、氯化铵、巴弗洛霉素A1以及所有能提高溶酶体pH值的溶酶体营养剂均能剂量依赖性地抑制与碱性磷酸钙晶体一起培养的成纤维细胞内的晶体溶解和(3H)-胸苷的^摄取。

将OFC晶体添加到单层成纤维细胞培养物中，细胞内钙离子浓度立即增加十倍，8分钟后恢复到基线水平。由于碱性磷酸钙晶体被添加到无钙培养基中，因此钙离子主要来源于细胞外离子。60分钟后观察到细胞内钙离子浓度再次增加，并持续至少3小时。此时，钙离子来源于溶解于吞噬溶酶体中的被吞噬晶体。

研究发现，OFC 晶体的促有丝分裂作用与作为生长因子的 PDGF 相似；与后者一样，OFC 晶体与 IGF-1 和血浆具有协同作用。阻断 IGF-1 会降低 OFC 引起的细胞有丝分裂。PG Mitchell 等人 (1989) 证明，OFC 晶体在 Balb/c-3 T3 成纤维细胞中诱导有丝分裂_{需要丝氨酸}/苏氨酸蛋白激酶 C (PKC) 的存在，PKC 是细胞在受到激素、神经递质和生长因子的外部刺激时产生的信号的主要介质之一。Balb/c-3 T3 细胞中 PKC 活性降低_会抑制OFC介导的原癌基因 c-fos 和 c-myc 的诱导，但不影响 PDGF 介导的对这些致癌基因的刺激。

吞噬晶体溶解后细胞内钙离子的增加并非有丝分裂发生的唯一信号通路。当血小板衍生生长因子（PDGF）等生长因子与其膜受体结合时，会刺激磷脂酶C（一种磷酸二酯酶）的分泌，其水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，形成细胞内信使肌醇-3-磷酸和二酰甘油。肌醇-3-磷酸通过调节钙依赖性酶和钙/钙调蛋白依赖性酶（例如蛋白激酶和蛋白酶）的活性，从内质网释放钙离子。

R. Rothenberg 和 H. Cheung (1988) 报道，在兔滑膜细胞中，磷脂酶C在OFC晶体刺激下，对磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的降解作用增强。OFC晶体显著增加了标记( ^3H )-肌醇的细胞中肌醇-1-磷酸的含量；峰值在1分钟内达到，并持续约1小时。

二酰甘油是焦磷酸钙二水合物的潜在激活剂。由于 OFC 晶体会增加磷脂酶 C 活性，从而导致二酰甘油积累，因此可以预期 PKC 活性会增加。PG Mitchell 等人 (1989) 比较了 OFC 晶体和 PDGF 对 Balb/c- _{3T3成纤维细胞}DNA 合成的影响。在细胞培养中，将细胞与肿瘤支持佛波醇二酯 (TPD)（一种二酰甘油类似物）一起孵育可灭活 PKC。长期低剂量 TPD 刺激会降低 PKC 活性，而单次高剂量刺激会激活 PKC 活性。PKC 灭活后，OFC 晶体对 DNA 合成的刺激受到抑制，表明该酶在 OFC 诱导的有丝分裂中的重要性。此前，GM McCarthy 等人(1987) 证明了人类成纤维细胞对 OFC 晶体的促有丝分裂反应与 PKC 激活之间存在联系。然而，OFC 晶体并不激活磷脂酰肌醇 3-激酶或酪氨酸激酶，这证实了 OFC 晶体激活细胞的机制具有选择性。

细胞增殖由一组称为原癌基因的基因控制。原癌基因 c-fos 和 c-myc 的产物 foe 和 mye 蛋白位于细胞核内，并与特定的 DNA 序列结合。用 OFC 晶体刺激 3T3 成纤维细胞，几分钟内即可导致 c-fos 表达，并在刺激后 30 分钟达到最大值。OFC 晶体或 PDGF 诱导 c-myc 转录在 1 小时内发生，并在刺激后 3 小时达到最大值。细胞维持 c-fos 和 c-myc 转录水平升高至少 5 小时。在 PCD 失活的细胞中，OFC 或 TFD 晶体对 c-fos 和 c-myc 的刺激作用受到显著抑制，而 PDGF 对这些基因的诱导作用则保持不变。

丝裂原活化蛋白激酶 (MAP K) 家族成员是多种细胞内信号转导级联的关键调节因子。该家族的一个亚类 p42/p44 通过激活原癌基因 c-fos 和 c-jun 的机制来调节细胞增殖。OFC 和 PFKD 晶体激活一条同时涉及 p42 和 p44 的蛋白激酶信号通路，提示该通路在含钙晶体诱导的丝裂原发生中发挥作用。

最后，OFC诱导的有丝分裂涉及转录因子核因子κB (NF-κB)，该因子最初被描述为免疫球蛋白κ轻链(IgK)基因。它是一种可诱导的转录因子，在许多信号通路中发挥重要作用，因为它调节多种基因的表达。NF-κB诱导通常伴随着抑制蛋白IκB从细胞质中释放。NF-κB诱导之后，活性转录因子会转位至细胞核。OFC晶体可在Balb/c- _3T3成纤维细胞和人类皮肤成纤维细胞中诱导NF-κB。

NF-κB激活后，信号转导可能涉及多种途径，但所有途径都涉及磷酸化（从而降解）IκB的蛋白激酶。基于体外研究，IκB此前被认为是激酶（例如PKC和蛋白激酶A）的底物。然而，最近发现了一种分子量较大的IκB激酶复合物。这些激酶特异性地磷酸化IκB的丝氨酸残基。TNF-α和IL-1激活NF-κB需要NF-κB诱导激酶（NIK）和IκB激酶的有效作用。NIK激活的分子机制目前尚不清楚。尽管OFC晶体能够同时激活PKC和NF-κB，但这两个过程之间的关联程度尚不清楚。由于GκB激酶修饰是通过磷酸化进行的，因此不能排除PKC通过磷酸化和激活GκB激酶，在OFC晶体诱导NF-κB中发挥作用的可能性。PKC抑制剂星形孢菌素（staurosporine）抑制OFC晶体诱导的有丝分裂和NF-κB表达，支持了这一观点。同样，星形孢菌素可以抑制GκB激酶，从而抑制蛋白激酶A和其他蛋白激酶。

因此，OFC晶体诱导成纤维细胞有丝分裂的机制至少包括两个不同的过程：

• 快速膜结合事件导致 PKC 和 MAP K 的激活，NF-κB 和原癌基因的诱导，
• ^{晶体在细胞内溶解的速度减慢，导致细胞内 Ca 2+}含量增加，进而激活许多刺激有丝分裂发生的钙依赖性过程。

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含钙MMP晶体的诱导

含钙晶体造成组织损伤的介质是MMPs——胶原酶-1、基质溶解酶、92kD明胶酶和胶原酶-3。

鉴于OFC晶体含量与关节组织破坏之间的关系，有人提出一个假设：OFC晶体以及可能的一些胶原蛋白会被滑膜细胞吞噬。受刺激的滑膜细胞会增殖并分泌蛋白酶。该假设已在体外进行了验证，方法是将天然或合成的OFC、PFCD和其他晶体添加到培养的人或犬滑膜细胞中。结果发现，中性蛋白酶和胶原酶的活性呈剂量依赖性增加，比未添加晶体的对照细胞培养物高出约5-8倍。

在含有晶体的培养基中培养的细胞中，检测到了胶原酶-1、基质溶解素和明胶酶-92 kDa mRNA 的共同诱导，随后酶分泌到培养基中。

OFC 晶体还诱导成熟猪软骨细胞中胶原酶 1 和胶原酶 2 mRNA 的积累，随后酶分泌到培养基中。

GM McCarty 等人 (1998) 研究了细胞内晶体溶解在晶体诱导的 MMP 生成中的作用。用 bafilomycin A 升高溶酶体 pH 值可抑制细胞内晶体溶解，并减弱人成纤维细胞对 OFC 晶体的增殖反应，但不会抑制 MMP 的合成和分泌。

碱性磷酸钙和 PFCD 晶体均不能在体外诱导 IL-1 的产生，但尿酸钠晶体可以。

目前的数据清楚地表明，成纤维细胞和软骨细胞与含钙晶体接触后会直接刺激 MMP 的产生。

骨关节炎的症状表明MMP在疾病进展中起着重要作用。含钙晶体的存在会加剧受累关节组织的退化。

刺激前列腺素合成

含钙晶体除了刺激细胞生长和酶分泌外，还能促使哺乳动物细胞培养物释放前列腺素，尤其是前列腺素E2 (PGE2) _{。所有情况下，} PGE2 的释放均发生在细胞接触晶体后的第一个小时内。R. Rothenberg (1987) 确定，合成PGE2 所需的花生四烯酸的主要来源_是磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，并证实磷脂酶A2_{和NOX是PGE2生成}的主要途径。

前列腺素E1（PGE1）也可在OFA晶体刺激下释放。GM McCarty等人（1993年、1994年）研究了PGE2 _、 PGE及其类似物米索前列醇对人成纤维细胞对OFA晶体促有丝分裂反应的影响。这三种药物均以剂量依赖性方式抑制了促有丝分裂反应，其中PGE和米索前列醇的抑制活性更为显著。PGE2和米索前列醇（而非PGE2 _）可抑制OFA晶体刺激下胶原酶mRNA的积累。

MG McCarty 和 H. Cheung (1994) 研究了 OFC 介导的 PGE 激活细胞的机制。作者发现，PGE 是一种比 PGE2 更强的细胞内 cAMP 诱导剂_，它通过 cAMP 依赖性信号转导途径抑制 OFC 诱导的有丝分裂和 MMP 生成。OFC 晶体诱导的 PGE 生成增加可能通过反馈机制削弱其其他生物学效应（有丝分裂和 MMP 生成）。

晶体引起的炎症

骨关节病患者的滑液中常发现含钙晶体，然而，无论是骨关节病还是晶体相关关节病（例如密尔沃基肩综合征），伴有白细胞增多的急性炎症发作均罕见。晶体的炎症潜能可被多种抑制因素改变。R. Terkeltaub 等人（1988 年）证实，血清和血浆能够显著抑制中性粒细胞对碱性磷酸钙晶体的反应。导致这种抑制的因素是晶体结合蛋白。对其中一种蛋白质_——2 -HS 糖蛋白 (AHSr) 的研究表明，AHSР 是中性粒细胞对 OFC 晶体反应最强效、最特异的抑制剂。AHSr 是一种源自肝脏的血清蛋白；已知与其他血清蛋白相比，它在骨骼和矿化组织中的浓度相对较高。此外，AHSr 存在于“非炎症”滑液中，并且在天然滑液中的碱性磷酸钙晶体中也检测到了 AHSr。因此，不能排除 AHSr 在体内调节碱性磷酸钙晶体的致炎潜能的可能性。

综上所述，我们提出了 WB van den Berg 等人提出的两种骨关节炎发病机制方案。 (1999) 和 M.Carrabba 等人。 (1996)，它结合了机械、遗传和生化因素。