骨关节炎的实验模型

软骨是一种高度特化的组织，仅包含一种细胞（软骨细胞），其特征是缺乏血管和淋巴管。软骨主要通过吸收滑液来获取营养。软骨细胞的代谢受软骨细胞及其周围组织局部产生的多种可溶性因子的调节。软骨细胞的功能还取决于细胞外环境的组成（氧张力、离子浓度、pH值等）、细胞外基质的组成、细胞与基质的相互作用以及物理信号。实验建模的主要目标是在不改变成熟细胞表型的情况下，在细胞外环境中建立培养物。第二个目标是建立培养物，以研究软骨细胞对化学和/或物理信号的过早、延迟、短期或长期反应。体外研究也为研究骨关节病中软骨细胞的行为提供了机会。第三个目标是开发共培养系统，以研究关节内各种组织的相互作用。第四项任务是准备用于后续移植的软骨植入物。最后，第五项任务是研究能够刺激修复和/或抑制软骨吸收的生长因子、细胞因子或治疗剂。

在过去的几十年中，人们创建了各种关节软骨细胞培养模型，包括单层培养、悬浮培养、软骨细胞培养、外植体培养、共培养和永生细胞培养。每种培养方法都有其优缺点，并且各自适用于研究软骨细胞代谢的某一特定方面。因此，软骨外植体是研究基质元素周转的绝佳模型，这需要真正的细胞表面受体以及正常的细胞-基质和基质-细胞相互作用。同时，建议在分离细胞培养上研究基质沉积或调节软骨细胞代谢的机制。低密度单层培养对于研究细胞分化过程至关重要。悬浮于天然或合成基质中的培养物是分析软骨细胞对机械应力适应性反应的模型。

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软骨细胞培养

在选择软骨组织进行体外研究时，应考虑几个要点。软骨细胞的基质组成和代谢活性因关节而异，后者还取决于软骨细胞在组织中的位置深度。这些数据是在几项实验中获得的，这些实验研究了从不同深度软骨区分离的软骨细胞亚群。研究发现，位于关节软骨浅层和深层的培养软骨细胞之间存在许多形态学和生化差异。浅层细胞合成稀疏、缺乏蛋白聚糖的纤维基质，而深层细胞则产生富含纤维和蛋白聚糖的基质。此外，与深层软骨细胞相比，浅层细胞产生相对更多的小分子非聚集性蛋白聚糖和透明质酸，以及相对较少的聚集蛋白聚糖和硫酸角质素。从不同深度软骨区分离的软骨细胞代谢的另一个重要特征是对外界刺激的反应。根据 M. Aydelotte 等人的研究，来自软骨浅层的牛软骨细胞对 IL-1 比来自深层的细胞更敏感。

细胞行为也取决于组织位置。同一动物的肋骨和耳软骨中的软骨细胞对成纤维细胞生长因子 (FGF) 和转化生长因子 (TGF-β) 等生长因子的反应不同。FGF 增加了培养肋骨中的胸苷、脯氨酸和亮氨酸掺入，但没有增加耳软骨细胞中的胸苷、脯氨酸和亮氨酸掺入。TGF-β 增加了胸苷掺入肋骨和耳软骨细胞中的胸苷，但对胸苷和脯氨酸掺入耳软骨细胞没有影响。来自高应力区域的软骨细胞与来自低应力区域的软骨细胞有所不同。因此，来自胫骨关节面中心区域（未被半月板覆盖，承受体内最大负荷）的成熟绵羊膝关节软骨细胞比来自半月板覆盖区域的细胞合成的聚集蛋白聚糖较少，但核心蛋白聚糖较多。作者还强调了在研究关节合成功能时使用来自相同关节区域的软骨的重要性。

软骨细胞的代谢及其对调节因子的反应也显著取决于供体的年龄、骨骼发育情况以及供体关节的状况。在人类软骨细胞中，随着年龄的增长，其增殖反应显著降低。40-50 岁和 60 岁以上供体的减幅最大。此外，对生长因子（如 FGF 和 TGF-β）的增殖反应的严重程度会随着年龄的增长而降低。软骨细胞增殖除了量变之外，还有质变。年轻供体（10-20 岁）的细胞对血小板衍生的生长因子 (PDGF) 的反应优于 TGF-β，而成年供体的细胞则相反。有几种机制可以解释软骨细胞合成功能及其对生长因子反应的年龄依赖性变化。这些包括表面细胞受体数量和亲和力的减少、生长因子和细胞因子的合成和生物活性的变化以及受体后信号的改变。

关节病理状态也会改变软骨细胞的形态和代谢活性。因此，J. Kouri 等人（1996）在骨关节病软骨中发现了三个软骨细胞亚群。来自软骨中部浅层和上层的软骨细胞形成簇，并合成大量的蛋白聚糖和胶原蛋白。转化生长因子-β (TGF-β) 和胰岛素样生长因子 (IGF) 能够刺激软骨细胞合成蛋白聚糖，并部分中和白介素-1 (IL-1) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 的作用。骨关节病软骨外植体和从骨关节病患者软骨中分离的软骨细胞对转化生长因子-β (TGF-β) 刺激的敏感性高于健康软骨细胞。这些差异很可能与关节软骨上层软骨细胞的表型变化有关。

通过用蛋白水解酶对 ECM 进行顺序处理，可以分离单个软骨细胞。分离的细胞从 ECM 中释放出来后，非常适合研究基质成分的从头合成。一些作者只使用梭菌胶原酶，而另一些作者则用胰蛋白酶、链霉蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和/或透明质酸酶预孵育软骨。分离细胞的数量取决于所使用的酶。因此，当仅用胶原酶处理时，可以从 1 g 组织中获得1.4-10 ^{6 个软骨细胞，而使用链霉蛋白酶、透明质酸酶和胶原酶时，则可以获得 4.3-106 个}。用胶原酶处理时，聚集蛋白聚糖、蛋白质、IL-6 和 IL-8 在细胞培养物中的残留量明显高于用不同酶顺序处理的情况。这两种细胞培养之间的差异有几种解释：

• 细胞受体被酶损伤或抑制，TGF-β抑制新鲜分离的软骨细胞（第1天）的DNA和蛋白多糖合成，而单层培养的软骨细胞（第7天）的DNA和蛋白多糖合成则受到TGF-β的刺激。然而，在实验开始前，需要足够的时间来重新表达这些膜成分。
• 外源性蛋白酶可破坏整合素介导的细胞-基质相互作用。整合素家族促进软骨细胞与细胞外基质（ECM）分子的附着 (Shakibaei M. et al., 1997)。这种破坏会影响基质基因的表达。
• 基质成分的残留可以调节软骨细胞的合成功能。整合素能够识别 ECM 降解产物，因此在蛋白水解酶作用后的组织修复中起重要作用。T. Larsson 等人（1989）报道，在细胞培养物中添加完整或片段化的蛋白多糖可刺激蛋白质和蛋白多糖的合成。然而，高水平的透明质酸导致鸡胚软骨细胞、猪成熟软骨细胞和大鼠软骨肉瘤细胞在蛋白多糖合成过程中硫酸盐的加入量显著减少。此外，即使在 IL-1β、TNF-α、FGF 存在的情况下，透明质酸也能抑制细胞释放蛋白多糖，这表明它抵消了生长因子和细胞因子的初始生物活性。透明质酸作用的确切机制仍不清楚；已知软骨细胞含有与胞质溶胶肌动蛋白丝相关的透明质酸受体。透明质酸与其受体结合可刺激蛋白质磷酸化。因此，这些数据表明，基质蛋白的碎片或天然分子通过激活细胞膜受体来调节软骨细胞的代谢功能。
• 酶快速刺激软骨细胞进行基质蛋白合成可能是软骨细胞形状和/或细胞骨架重组改变的结果。
• 一些细胞因子（例如IL-8）和生长因子（例如IGF-1、TGF-β）被隔离在ECM中。最著名的例子是TGF-β与核心蛋白聚糖结合，导致前者诱导中国仓鼠卵巢细胞生长的能力下降。软骨中核心蛋白聚糖含量随年龄增长而增加的发现表明TGF-β的生物利用度会随着年龄增长而降低。生长因子和细胞因子可能在培养过程中从基质碎片中释放出来，随后调节软骨细胞功能。

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软骨细胞单层培养

软骨细胞分化表型的主要特征是合成 II 型胶原蛋白和组织特异性蛋白聚糖，以及有丝分裂活性低。有证据表明，随着单层细胞培养时间的延长以及多次重复细胞传代，软骨细胞会失去其球形轮廓，并呈现细长的成纤维细胞样形状。在这种成纤维细胞化生中，细胞的合成功能也会发生改变，特征是 II、IX 和 XI 型胶原蛋白的合成逐渐减少，而 I、III 和 Y 型胶原蛋白的合成增加。由于功能性聚集蛋白聚糖，会合成小的非聚集蛋白聚糖。在分化细胞中，组织蛋白酶 B 和 L 的合成极低，但在分化丧失的过程中会增加。胶原酶-1 在分化的软骨细胞中表达；随着培养时间的延长，其表达减少，而金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的产生增加。

分化后的软骨细胞从单层转移到悬浮培养时，会重新表达分化表型的胶原蛋白。分化过程可能与细胞形状有关。研究人员经常利用这一特性来研究自体软骨细胞移植的缺陷移植。从活检材料中提取的少量细胞可以在单层培养中扩增，然后在移植前重新引入三维基质中。TGF-β、骨胶原-羟基磷灰石复合物和抗坏血酸可以刺激去分化软骨细胞转移到琼脂糖培养基中，重新表达特定的表型。

在生长因子和细胞因子的作用下，软骨细胞在分化过程中会发生改变。未分化和分化软骨细胞对细胞因子和生长因子的反应有所不同。IL-1 刺激成纤维细胞增殖，而未分化软骨细胞的生长则受到 IL-1 的抑制。IGF-1 刺激细长而非扁平的软骨细胞进行 DNA 合成。在分化的软骨细胞中，IL-1β 和 TNF-α 对原胶原酶产生的刺激作用比未分化的软骨细胞更明显。

软骨细胞培养

在液体培养基或天然或合成的三维基质中悬浮培养软骨细胞，可以稳定软骨细胞的表型。细胞保持其球形并合成组织特异性蛋白质。通常建议采用悬浮培养软骨细胞来研究新的细胞周围基质的形成。在合成或天然的吸收性聚合物中培养软骨细胞，可用于将细胞植入软骨缺损处，以刺激关节软骨组织的再生。用于植入细胞的合成或天然培养基必须满足以下要求：

• 植入物必须具有多孔结构，以便细胞粘附和生长，
• 聚合物本身及其降解产物在植入体内时均不会引起炎症或毒性反应，
• 移植载体必须能够与邻近的软骨或软骨下骨结合，
• 天然或合成基质必须具有吸收能力，其降解必须通过组织再生来平衡，
• 为了促进软骨修复，基质的化学结构和孔隙结构必须有利于维持细胞表型，以及其中的软骨细胞合成组织特异性蛋白质，
• 在体内植入过程中，有必要研究合成或天然基质的机械性能。

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液相软骨细胞悬浮液

通过在培养软骨细胞的塑料容器壁上涂抹甲基纤维素、琼脂糖、水凝胶（聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯）或胶原蛋白-琼脂糖混合物，可以防止细胞粘附在容器上。在这些条件下，软骨细胞会形成簇集，主要合成聚集蛋白聚糖和组织特异性胶原蛋白（II、IX、XI型）。通常会发现两种类型的细胞。位于中心的细胞保持球形，并被发达的细胞外基质（ECM）所包围，这已通过组织化学和超微结构研究得到证实。在外围，软骨细胞具有盘状轮廓，并被稀疏的细胞外基质（ECM）所包围；人们对此类细胞的功能特征知之甚少。

可以在悬浮状态的微载体上培养软骨细胞；可以使用葡聚糖珠（Cytodex）、胶原蛋白包被的葡聚糖珠（Cytodex III）以及I型胶原蛋白的无孔微球（Cellagen）作为微载体。在这些培养条件下，软骨细胞附着在微载体表面，保持其球形，并产生基质状物质。此外，Cellagen的使用可以促进软骨细胞增殖并重新表达正常表型。因此，在Cellagen微球上培养软骨细胞可用于在移植前恢复细胞表型。

在液体培养基中培养软骨细胞悬浮液的另一种方法是将其培养成由0.5-1 * 10个细胞组成的致密球状细胞^，并通过离心获得。此类软骨细胞能够产生含有大量蛋白聚糖、II型胶原蛋白（但不含有I型胶原蛋白）的基质，这已通过组织学、免疫组织化学和定量方法得到证实。

软骨细胞在天然 ECM 中的悬浮

软骨细胞可以在三维基质（软琼脂、琼脂糖、胶原凝胶或海绵、透明质酸、纤维蛋白胶、藻酸盐珠）中悬浮培养。

在琼脂糖中培养的软骨细胞保留其正常表型，并合成II型胶原蛋白和组织特异性聚集体。在琼脂糖中培养时，细胞合成的蛋白聚糖会在50天内释放到培养基中。相比之下，在单层培养中，在培养的前5-6天，细胞相中就已经充满了糖胺聚糖；在培养基中培养时，在前8-10天，糖胺聚糖的合成和释放增加，之后其数量会随着时间推移而减少。然而，在琼脂糖中培养的软骨细胞的行为与体内不同。在琼脂糖中，大量合成的聚集体比体内的分子更小，分子更少。TGF-β刺激外植体中的蛋白聚糖合成，但在琼脂糖中抑制聚集体的合成。

藻酸盐是从褐藻中提取的线性多糖。在二价阳离子（例如Ca ²⁺离子）存在下，这种聚合物会变成凝胶。每个被藻酸盐捕获的软骨细胞都被一层带负电荷的多糖基质包围，这些多糖的孔隙与透明软骨的孔隙相似。藻酸盐珠中的软骨细胞形成的基质由两部分组成：一层薄薄的细胞相关基质，相当于关节软骨的细胞周围和区域基质；以及一层更远的基质，相当于天然组织中的区域间基质。在培养第30天，藻酸盐珠中细胞以及两个区域所占的相对体积和绝对体积几乎与天然软骨中的体积完全相同。在近30天的时间里，软骨细胞保持其球形并产生聚集蛋白聚糖，其流体动力学特性与关节软骨基质中的聚集蛋白聚糖分子以及II、IX和XI型胶原分子相似。同时，与其他悬浮培养一样，扁平状细胞存在于藻酸盐珠表面，产生少量I型胶原分子，这些分子直接释放到培养基中，不会掺入ECM。在藻酸盐珠中观察到软骨细胞的中度增殖。在藻酸盐凝胶中培养8个月后，成熟的软骨细胞不会失去代谢活性，并继续合成组织特异性II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖。

H. Tanaka 等人 (1984) 研究了各种天然分子在海藻酸盐中的扩散特性，发现分子量大于 70 kDa 的分子无法在海藻酸盐中扩散。因此，在海藻酸盐中培养细胞适用于研究基质生物合成和细胞外基质 (ECM) 组织的调控。在海藻酸盐中培养细胞的可行性使我们能够研究肽调节因子和药物在转录、转录后和翻译水平上的作用。

软骨细胞也可在I型和II型胶原纤维基质中培养。S. Nehrer等人（1997）比较了犬软骨细胞在含有不同类型胶原的多孔胶原蛋白多糖聚合物基质中的功能。他们发现，在含有I型和II型胶原的胶原基质中培养的软骨细胞的生物合成功能形态存在显著差异。在II型胶原基质中，细胞保持球形，而在I型胶原基质中，细胞呈现成纤维细胞样形态。此外，在II型胶原基质中，软骨细胞产生的糖胺聚糖含量更高。J. van Susante等人（1995）比较了在藻酸盐和I型胶原凝胶中培养的软骨细胞的特性。作者发现胶原凝胶中的细胞数量显著增加，但从培养第6天开始，细胞失去了其特征性表型，变成了成纤维细胞样细胞。在藻酸盐凝胶中，观察到细胞数量减少，但软骨细胞保持了其正常表型。在胶原凝胶中，每个细胞的蛋白多糖数量明显高于藻酸盐凝胶，但从培养第6天开始，在胶原凝胶中观察到基质元素合成减少，而在藻酸盐凝胶中，基质元素合成持续增加。

固体三维纤维蛋白基质是一种天然物质，可支持悬浮于其中并呈现分化表型的软骨细胞。三维纤维蛋白基质也可用作软骨细胞移植的载体。纤维蛋白的优势在于其无细胞毒性、填充空间的能力和粘附性。组织学和生化研究、放射自显影和电子显微镜检查表明，即使在培养两周后，纤维蛋白凝胶中的软骨细胞仍能保持其形态、增殖并产生基质。然而，G. Homminga 等人（1993 年）的报道指出，纤维蛋白在培养 3 天后开始崩解，软骨细胞去分化随之进行。

人工（合成）ECM中的软骨细胞悬浮液

通过在合成的生物相容性基质中体外培养分离的软骨细胞，可以获得用于重建或整形外科手术的软骨植入物。

在聚乙醇酸中培养的软骨细胞增殖并维持正常形态和表型达8周。软骨细胞-聚乙醇酸复合物由细胞、糖胺聚糖和胶原蛋白组成，并带有外部胶原蛋白囊。然而，此类植入物含有两种胶原蛋白分子——I型和II型。通过一系列传代去分化的软骨细胞制成的植入物比原代未分化软骨细胞制成的植入物含有更多的糖胺聚糖和胶原蛋白。

L. Freed 等人 (1993b) 比较了人类和牛软骨细胞在纤维聚乙醇酸 (FPGA) 和多孔聚乳酸 (PPLA) 中的培养行为。在 FPGA 或 PPLA 中培养牛软骨细胞 6-8 周后，作者观察到细胞增殖和软骨基质再生。在 FPGA 中，软骨细胞呈球形，位于被软骨基质包围的陷窝中。体外培养 8 周后，再生组织含有高达 50% 的干物质（4% 的细胞质量、15% 的糖胺聚糖和 31% 的胶原蛋白）。在 PPLA 中，细胞呈梭形，并含有少量的糖胺聚糖和胶原蛋白。在 FPGA 中，细胞生长强度是 PPLA 中的 2 倍。在体内实验中，在VPGK和PPLC中生长的软骨细胞在1-6个月内可生成组织学上与软骨相似的组织。植入物含有糖胺聚糖、I型和II型胶原蛋白。

将牛胎儿软骨细胞培养于多孔高密度疏水和亲水聚乙烯中。在两种基质中孵育7天后，细胞仍保持球形，主要含有II型胶原蛋白。培养21天后，发现亲水基质中II型胶原蛋白的含量高于疏水基质。

软骨组织也可以通过在Millicell-CM滤膜上进行单层培养来获得。为了使软骨素附着，需要预先用胶原蛋白涂覆滤膜。培养物的组织学检查表明，软骨细胞在含有蛋白多糖和II型胶原蛋白的细胞外基质（ECM）中积累。在这种培养物中未检测到I型胶原蛋白。获得的软骨组织中的软骨细胞呈球形，但在组织表面略微扁平。新生组织的厚度随时间推移而增加，并且取决于细胞单层的初始密度。在最佳培养条件下，软骨组织的厚度可达110μm，其细胞和胶原蛋白的表层和深层结构与关节软骨相似。ECM中胶原蛋白和蛋白多糖的含量约为普通软骨的3倍。培养2周后，观察到基质积累，可以从滤膜中提取组织并用于移植。

Sims等人（1996）研究了在聚环氧乙烷凝胶中培养软骨细胞。聚环氧乙烷凝胶是一种封装的聚合物基质，可通过注射转移大量细胞。将软骨细胞注射到无胸腺小鼠的皮下组织六周后，新软骨形成，其形态学特征为类似于透明软骨的白色乳光。组织学和生化数据表明存在活跃增殖的软骨细胞，并产生细胞外基质（ECM）。

移植

软骨组织移植用于研究其合成和分解代谢过程、体内平衡维持、吸收和修复。软骨外植体中的软骨细胞保持正常的表型和 ECM 组成，与体内关节软骨相似。在血清存在下培养 5 天后，可达到恒定的合成水平和自然降解过程。在主培养和添加血清的培养中使用多种物质（例如 IL-IB、TNF-a、细菌脂多糖、视黄酸衍生物或活性氧自由基）可以加速组织吸收。为了研究软骨修复，其损伤是由可溶性炎症介质（H ₂ O ₂、IL-1、TNF-a）或基质的物理破裂引起的。

器官型培养法是体外研究孤立外界因素对软骨细胞及其周围基质影响的模型。在体内，软骨细胞稀疏地分布在细胞外基质 (ECM) 中，彼此不接触。关节软骨外植体培养保留了这种结构组织，以及软骨细胞与周围细胞外环境之间的特定相互作用。该模型也用于研究机械应力、药物、生长因子、细胞因子和激素对软骨代谢的影响。

软骨组织移植的另一个优点是，在分离细胞时，蛋白水解酶或机械因素不会对软骨细胞造成损伤，而这些损伤是不可避免的。受体、其他膜蛋白和糖蛋白都受到保护，免受损伤因素的影响。

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软骨培养

软骨单元是关节软骨的结构、功能和代谢单位，由软骨细胞、细胞周围基质和致密的丝状囊组成，负责维持基质稳态。软骨单元采用机械方法从软骨中提取，并通过多次连续的低速匀浆处理进行收集。从不同软骨深度区域分离的软骨单元可分为四类：单个软骨单元、成对软骨单元、多个（三个或三个以上）线性排列的软骨单元（软骨柱）和软骨单元簇。

单个软骨单元通常存在于完整软骨的中层，成对的软骨单元位于中层和深层的边界，线性排列的多个软骨单元是完整软骨深层的典型特征。最后，软骨单元簇由随机组织的单个和成对的软骨单元群体组成，它们在均质化后仍保持聚集状态。软骨单元簇是大的软骨碎片，通常包含多个软骨单元和放射状排列的胶原纤维，这是基质深层的典型组织特征。软骨单元被固定在透明琼脂糖中，这使得研究它们的结构、分子组成和代谢活性成为可能。软骨单元-琼脂糖系统被认为是软骨的微模型，它与传统的软骨细胞-琼脂糖系统的不同之处在于保留了天然的微环境，并且不需要合成和组装。软骨培养是研究正常和病理条件下关节软骨中细胞和基质相互作用的模型。

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永生软骨细胞的培养

能够使细胞“永生化”的重组DNA或含致癌基因的病毒可用于构建永久细胞系。永生软骨细胞能够无限增殖，同时保持稳定的表型。F. Mallein-Gerin等人（1995）发现，SV40T致癌基因可诱导小鼠软骨细胞增殖，并持续稳定表达II、IX和XI型胶原蛋白以及关节聚集蛋白和结合蛋白。然而，此类细胞系在单层培养或琼脂糖凝胶中培养时，会获得合成I型胶原蛋白的能力。

W. Horton 等人（1988）描述了一种II型胶原mRNA表达水平较低的永生细胞系。这些细胞是通过用含有I-myc和y-ra致癌基因的小鼠逆转录病毒转化而获得的。这类细胞为研究在缺乏II型胶原的情况下关节基质的相互作用以及II型胶原合成的调控提供了一种独特的模型。

培养基因突变或缺失的软骨细胞是研究其生理功能的便捷模型。该模型特别适用于研究特定分子在软骨基质组织中的作用或研究各种调节因子对软骨代谢的影响。IX 型胶原基因缺失的软骨细胞合成的胶原原纤维比正常情况更宽，这表明 IX 型胶原调节着原纤维的直径。如第一章所述，最近在患有原发性全身性骨关节炎的家族中发现了编码 II 型胶原的 COLAI 基因的突变。为了研究突变型 II 型胶原对关节基质的影响，R. Dharmrvaram 等人 (1997) 将缺陷型 COL ₂ AI（第 519 位的精氨酸被半胱氨酸取代）转染（感染外来核酸）到体外人类胎儿软骨细胞中。

共培养系统。在关节中，软骨与滑膜、滑液、韧带和软骨下骨中的其他类型细胞相互作用。上述细胞合成的各种可溶性因子会影响软骨细胞的代谢。因此，在关节炎中，关节软骨会被滑膜细胞产生的蛋白水解酶和自由基破坏。因此，人们开发了一些模型来研究软骨与周围组织之间的复杂相互作用，这些模型被称为共培养。

S. Lacombe-Gleise 等人 (1995) 在共培养系统 (COSTAR) 中培养了兔软骨细胞和成骨细胞，其中细胞被微孔膜 (0.4 μm) 隔开，从而允许两种细胞之间进行交换，而无需任何直接接触。这项研究证明了成骨细胞能够通过可溶性介质刺激软骨细胞生长。

AM Malfait 及其合著者（1994 年）研究了外周血单核细胞与软骨细胞之间的关系。该模型便于研究炎症性关节病（类风湿性关节炎、血清阴性脊柱关节病等）中细胞因子介导的过程。该模型的作者使用孔径为 0.4 μm 的蛋白结合膜分离细胞。研究表明，受脂多糖刺激的单核细胞产生 IL-1 和 TNF-α，它们抑制软骨细胞合成聚集蛋白聚糖，并促进已合成的聚集蛋白聚糖的降解。

K. Tada 等人 (1994) 创建了一种共培养模型，将I型胶原凝胶中的内皮细胞置于一个内腔中，内腔与装有软骨细胞的外腔通过孔径为0.4 μm的滤膜隔开。在与外腔完全隔离的状态下，在EGF或TGF-α存在下，人内皮细胞在胶原凝胶中形成管状结构。当同时培养这两种细胞时，内皮细胞依赖TGF-α的管状结构形成受到抑制。抗TGF-β抗体可部分消除软骨细胞对这一过程的抑制。可以推测，软骨细胞产生的TGF-β抑制了软骨本身的血管化。

S. Groot 等人 (1994) 将 16 日龄小鼠胎儿骨骼肥大区和增生区的软骨细胞与脑组织碎片同时培养。培养 4 天后，观察到软骨细胞向成骨细胞的分化，并开始出现类骨质形成。培养 11 天后，部分软骨被骨组织取代，骨基质部分钙化。脑组织产生的一些神经肽和神经递质会影响成骨细胞的代谢或具有其受体。其中包括去甲肾上腺素、血管活性肠肽、降钙素基因相关肽、P 物质和生长抑素。与软骨细胞一起培养的脑组织碎片可以产生一些列出的能够诱导软骨细胞向成骨细胞分化的因子。

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外界因素对软骨细胞培养的影响

氧张力对软骨细胞代谢的影响

在大多数情况下，软骨细胞培养是在大气氧张力条件下发育的。然而，众所周知，体内软骨细胞存在于缺氧环境中，而氧张力在不同病理条件下会发生变化。在成熟过程中，骨骺的血液供应会发生显著变化。由于生长板不同区域的血管分布不同，因此这些区域的氧张力也不同。C. Brighton 和 R. Heppenstall（1971）证明，在兔胫骨板中，肥大区的氧张力低于周围软骨。一些代谢参数的测量表明，软骨细胞能够对局部氧浓度的变化做出快速反应。首先，在低氧张力下，软骨细胞对氧的消耗会降低。当氧张力从21%降至0.04%时，葡萄糖利用率会增加，糖酵解酶的活性和乳酸的合成也会增加。即使在低氧张力下，ATP、ADP和AMP的绝对量也保持稳定。这些数据表明，软骨细胞代谢的目标是最大限度地节约能量。然而，在缺氧条件下，合成活性以及修复过程会发生变化。

高氧张力也会影响软骨细胞代谢，导致蛋白多糖和DNA合成减少，软骨基质降解。这些影响通常伴有自由基的产生。

环境离子浓度和渗透压对软骨细胞功能的影响

在天然软骨中，离子浓度与其他组织有显著差异：细胞外培养基中的钠含量为250-350 mmol，渗透压为350-450 mosmol。当从细胞外基质（ECM）中分离软骨细胞并在标准培养基（DMEM，渗透压为250-280.7 mosmol）中培养时，细胞周围的环境会发生显著变化。此外，标准培养基中的钙和钾浓度明显低于天然组织，而阴离子浓度明显高于天然组织。

^{向培养基中添加蔗糖会增加其渗透压，并诱导细胞内H +}和细胞质中钙离子浓度的瞬时增加。这种细胞内变化会影响软骨细胞分化过程及其代谢活性。J. Urban等人（1993）发现，在标准DMEM中孵育2-4小时的分离软骨细胞对³⁵ 8-硫酸盐和³ H-脯氨酸的掺入量仅为天然组织中的10％。在新鲜分离的软骨细胞和软骨组织外植体中，当细胞外培养基的渗透压为350-400 mosmol时，合成强度达到最大值。此外，将分离的细胞放入指定渗透压的标准DMEM后，软骨细胞的体积增加了30-40％。然而，当在非生理渗透压条件下培养软骨细胞 12-16 小时时，细胞会适应新的条件，并根据细胞外环境渗透压的变化降低生物合成的强度。

P. Borgetti 等人 (1995) 研究了细胞外培养基渗透压对猪软骨细胞生长、形态和生物合成的影响。作者证实，在渗透压为 0.28 和 0.38 mosmol 的培养基中培养的软骨细胞具有相似的生化和形态特征。在 0.48 mosmol 的培养基渗透压下，培养后的最初 4-6 小时内观察到细胞增殖和蛋白质合成下降，但这些参数随后恢复并最终达到对照值。当在渗透压为 0.58 mosmol 的培养基中培养软骨细胞时，细胞失去了维持增殖过程生理强度的能力，6 天后软骨细胞数量显著减少。在 0.58 mosmol 的培养基渗透压下，观察到蛋白质合成受到显著抑制。此外，在渗透压为0.28-0.38 mOsm的培养基中培养时，软骨细胞仍保持其生理表型；在更高的渗透压（0.48-0.58 mOsm）下，细胞形态发生显著变化，表现为特征性表型的丧失、软骨细胞转化为成纤维细胞样细胞以及细胞组装基质蛋白聚糖的能力丧失。本研究结果表明软骨细胞对细胞外环境渗透压的有限波动具有响应能力。

其他离子浓度的变化也会影响软骨细胞的生物合成过程。因此，随着钾离子浓度从 5 mmol（标准 DM EM 培养基中的浓度）增加到 10 mmol（体内 ECM 中的浓度）， ³⁵ S（硫酸盐）的掺入程度会增加一半。低于 0.5 mmol 的钙浓度促进成熟牛软骨细胞产生胶原蛋白，而 1-2 mmol 的钙浓度（相当于标准 DM EM 培养基中的浓度）会导致胶原蛋白合成显著下降。在高钙水平（2-10 mmol）下观察到生物合成的适度增加。各种阳离子都参与软骨细胞与 ECM 蛋白的附着。因此，镁离子和锰离子有助于软骨细胞与纤连蛋白和 II 型胶原蛋白的附着，而钙离子不参与软骨细胞与蛋白质的附着。因此，所述研究的结果表明细胞外离子钾、钠、钙和培养基渗透压的变化对在标准培养基中培养的软骨细胞生物合成功能的影响。

机械应力对软骨细胞代谢的影响

关节制动会导致可逆性软骨萎缩，这表明需要机械刺激来维持细胞外基质（ECM）的正常代谢过程。在大多数情况下，所使用的细胞培养模型存在于正常大气压下。M. Wright 等人（1996）表明，机械环境会影响软骨细胞代谢，细胞反应取决于压缩负荷的强度和频率。对完整关节软骨外植体进行体外负荷实验表明，在静态负荷作用下，蛋白质和蛋白聚糖的合成减少，而动态负荷则会刺激这些过程。机械负荷对软骨影响的具体机制很复杂，可能与细胞变形、静水压、渗透压、电位以及细胞表面基质分子受体有关。为了研究每个参数的影响，需要建立一个可以独立改变每个参数的系统。例如，外植体培养不适合研究细胞变形，但它可以用来研究压力对软骨细胞代谢活性的总体影响。软骨受压会导致细胞变形，并伴随静水压力梯度、电位、液体流动以及基质含水量、电荷密度和渗透压等物理化学参数的变化。细胞变形可以通过将分离的软骨细胞浸入琼脂糖或胶原凝胶中来研究。

已开发出多种系统来研究机械刺激对软骨细胞培养的影响。一些研究人员使用通过气相对细胞培养物施加压力的系统。例如，JP Veldhuijzen 等人（1979 年）以高于大气压 13 kPa 的压力和低频率（0.3 Hz）持续 15 分钟，观察到 cAMP 和蛋白聚糖的合成增加，而 DNA 合成减少。R. Smith 等人（1996 年）表明，将原代牛软骨细胞培养物间歇性地置于频率为 1 Hz 的静水压力（10 MPa）下 4 小时，可导致聚集蛋白聚糖和 II 型胶原蛋白的合成增加，而恒定压力则不会影响这些过程。Wright 等人（1996 年）使用类似的系统报告称，对细胞培养物施加周期性压力与软骨细胞膜的超极化和 Ca ²⁺依赖性钾通道的激活有关。因此，周期性压力的作用是由软骨细胞膜上的拉伸激活离子通道介导的。软骨细胞对静水压力的响应取决于细胞培养条件和施加负荷的频率。因此，周期性静水压力（5 MPa）在频率为0.05、0.25和0.5 Hz时会降低硫酸盐掺入软骨细胞单层的速度，而在频率大于0.5 Hz时，会增加硫酸盐掺入软骨外植体的速度。

M. Bushmann 等人（1992 年）报道，琼脂糖凝胶中的软骨细胞在静态和动态机械负荷下会改变生物合成，其方式与培养的完整器官相同。作者发现，机械负荷会产生高渗刺激，随后导致软骨细胞 pH 值下降。

可以研究机械拉伸对浸入凝胶中的细胞培养物的影响。可以使用计算机控制的真空产生拉伸力。当系统处于一定真空度时，装有细胞培养物的培养皿底部会拉伸一定量，变形在培养皿底部边缘最大，中心最小。拉伸也会传递到培养皿中培养的软骨细胞。K. Holm-vall 等人 (1995) 使用这种方法发现，在胶原蛋白（II 型）凝胶中培养的软骨肉瘤细胞中，α2-整合素的 mRNA 表达增加_{。α2β整合素}能够与 II 型胶原蛋白结合。它被认为是一种机械感受器，因为它与肌动蛋白结合蛋白相互作用，从而连接细胞外基质 (ECM) 和细胞骨架。

PH对软骨细胞代谢的影响

软骨组织细胞外基质（ECM）的间质液pH值比其他组织更酸性。A. Maroudas（1980）测定关节软骨基质的pH值为6.9。B. Diamant等人（1966）发现病理条件下的pH值为5.5。已知软骨细胞在低氧分压（PO2）下生存，这表明糖酵解（占所有葡萄糖代谢的95%）在这些细胞代谢中发挥着重要作用；糖酵解伴随着大量乳酸的产生。

除了糖酵解产物对环境的酸化作用外，基质成分本身也非常重要。蛋白聚糖上大量的固定负电荷会改变细胞外的离子组成：观察到高浓度的自由阳离子（例如，H ⁺、Na ⁺、K ⁺）和低浓度的阴离子（例如，O2、HCO3 ）。此外，在机械负荷的影响下，水分从 ECM 中排出，导致固定负电荷浓度增加，并吸引更多的阳离子进入基质。这同时伴有细胞外环境 pH 值的降低，这会影响细胞内 pH 值，进而改变软骨细胞的代谢。R. Wilkin 和 A. Hall（1995）研究了细胞外和细胞内环境 pH 值对分离的牛软骨细胞基质生物合成的影响。他们观察到基质合成随着 pH 值的降低而发生双重改变。 pH值略微降低（7.435SO4和^3H-_脯氨酸进入软骨细胞的量增加50% ，而培养基深度酸化（pH<7.1）则与对照组相比，软骨细胞的合成量抑制了75%。使用铵离子产生低pH值（6.65）仅导致基质合成减少20%。结果表明，基质合成的细胞外培养基pH值的改变不能仅通过细胞内培养基pH值的变化来解释。此外，软骨细胞能够通过Na ⁺、H ⁺交换器、Ka ⁺依赖的Cl_ ^- NOS3转运体和H ⁺ /ATP酶来调节细胞内pH值。

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培养基成分对软骨细胞代谢的影响

培养软骨细胞的培养基必须与实验条件相适应。近年来，人们已开始使用小牛血清来优化培养条件。然而，使用血清时，必须考虑以下几点：

• 器官培养中组织边缘细胞向外生长，
• 不同系列血清成分的变化，
• 其中存在未知成分，
• 在研究各种生物因素对细胞代谢活动的影响时，干扰和伪影的风险增加。

后者的一个例子是EGF对大鼠软骨细胞作用的研究。EGF刺激3H-胸苷的掺入^，并增加培养物中DNA含量。这种效应在低血清浓度（<1%）时更为明显，但在高浓度（>7.5%）时，这种效应消失。

众所周知，与体内条件相比，在添加了小牛血清的 DMEM 中，合成和降解水平显著提高。体内和体外代谢的差异可能是由于滑液和细胞培养培养基的差异造成的。Lee 等人 (1997) 使用含有添加了 20% 小牛血清的 DMEM 和大量正常同种异体滑液的营养培养基在琼脂糖中培养幼牛软骨细胞。培养基中的滑液存在导致蛋白多糖含量增加，最高可达滑液总量的 80%。这些结果表明，培养的滑液诱导的代谢水平与体内相似，即糖胺聚糖合成水平高，细胞分裂水平低。

G. Verbruggen 等人 (1995) 证明，在无血清 DMEM 的琼脂糖培养基中培养的人软骨细胞³⁵ S-arrpeKaHa 合成水平仅为添加 10% 小牛血清的 DMEM 培养基中观察到的合成水平的 20-30%。作者确定了 IGF-1、IGF-2、TGF-R 或胰岛素在无血清培养基中恢复聚集蛋白聚糖生成的程度。作者得出结论，100 ng/ml 胰岛素、IGF-1 或 IGF-2 可部分恢复聚集蛋白聚糖合成，使其达到对照水平的 39-53%。未观察到上述因素组合产生的协同作用或累积作用。同时，在 100 ng/ml 胰岛素存在下，10 ng/ml TGF-R 可刺激聚集蛋白聚糖合成达到参考水平的 90% 或更高。最后，人血清转铁蛋白单独或与胰岛素联合使用均不影响聚集蛋白聚糖的合成。当用牛血清白蛋白替代小牛血清时，聚集蛋白聚糖的含量显著降低。用胰岛素、胰岛素样生长因子 (IGF) 或转化生长因子受体 (TGF-R) 富集培养基可部分恢复细胞产生聚集蛋白聚糖的能力。此外，IGF-1 和胰岛素能够维持细胞培养中的稳态。在富含 10-20 ng/ml IGF-1 的培养基中培养 40 天后，蛋白聚糖合成维持在与含有 20% 小牛血清的培养基相同甚至更高的水平。在富含 IGF-1 的培养基中，分解代谢过程比在富含 0.1% 白蛋白溶液的培养基中进展得更慢，但在富含 20% 血清的培养基中进展得更快。在长寿命培养中，20 ng/ml IGF-1 可维持细胞的稳定状态。

D. Lee 等人 (1993) 比较了培养基组成（DMEM、DMEM+20% 小牛血清、DMEM+20 ng/ml IGF-1）对软骨组织外植体培养、单层培养和琼脂糖悬浮液中 DNA 合成的影响。在含血清的琼脂糖中培养时，作者观察到软骨细胞倾向于聚集成大的簇。不含血清或含 IGF-1 培养的细胞在琼脂糖中保持圆形，聚集成小团块，但没有形成大的聚集体。在单层培养中，含血清培养基中的 DNA 合成显著高于含 IGF-1 培养基中的 DNA 合成；后者的 DNA 合成显著高于未富集培养基中的 DNA 合成。在未富集培养基和含 IGF-1 培养基的琼脂糖悬浮液中培养软骨细胞时，DNA 合成无差异。同时，与其他培养基相比，在富含血清的培养基中培养琼脂糖中的软骨细胞悬浮液可增加放射性核苷酸³ H-胸苷的掺入。

维生素C是激活参与形成胶原纤维稳定螺旋结构的酶所必需的。缺乏抗坏血酸的软骨细胞会合成羟基化不足的非螺旋胶原前体，这些前体分泌缓慢。添加抗坏血酸（50 μg/ml）可导致II型和IX型胶原羟基化，并使其分泌量正常。添加维生素C不会影响蛋白多糖的合成水平。因此，胶原蛋白的分泌与蛋白多糖的分泌无关。

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